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普通烟草(Nicotiana tabacum L)主栽品种的遗传背景狭窄，形态学上相似程度高，迫切需要从分子水平上鉴定。本研究利用烟草公共序列数据和已经拼接好的烟草EST数据，通过生物信息学方法，在烟草中设计了大量的PIP和SSR标记，并合成其中部分引物进行遗传多样性分析，以及建立烟草主栽品种指纹图谱，获得以下结果：1、开发了12,388个PIP分子标记和76,848个SSR分子标记。将这些分子标记的信息都已经上传到数据库网站(http://yancao.sdau.edu.cn/tgb/)上供免费下载。2、e-PCR结果表明，PIP和SSR标记广泛分部在整个烟草基因组上，两种标记交叉重叠率为1.68%，98.32%均匀分布在其基因组上。其中每10kb出现的频率PIP标记是3.07对，SSR标记是1.72对。3、从数据库中，分别随机挑选22对PIP和SSR标记对64份烟草种质资源进行遗传多样性分析，PIP和SSR标记分别检测到153个和166个等位位点，两种标记扩增产物平均长度分别为159.1bp和498bp。SSR标记的PIC值平均为0.656，高于PIP标记(0.540)。对于扩增到的稀有位点数(出现频率小于0.05)PIP和SSR标记扩增数量相差不多，分别为0.32个和0.35个。但出现频率小于0.01的稀有位点数，PIP标记平均每个位点分别扩增到2.0个位点明显多于SSR标记的0.7个。4、聚类结果表明，由于PIP标记在普通烟草种内遗传相似系数高，不能很好的区分种内材料，而SSR在普通烟草种内多态性较高，弥补了PIP标记的不足。但是，SSR标记过高的多态性不适合种间的分类，而PIP标记跨物种的保守性相对SSR标记要高，适合种间的聚类分析。故两种标记联合使用可充分发挥各自的优点。5、从62对候选SSR引物中筛选出21对多态性高、稳定性好的引物作为核心引物，构建9份烟草主栽品种DNA指纹图谱；共扩增出125个基因位点；各个品种之间遗传相似系数变化范围为0.507~0.916，平均为0.726。聚类结果显示，同一来源育成的品种聚在一类，说明它们的遗传关系较近。引物鉴别能力PIC值的变化范围0.37~0.86，平均值为0.67，其中9对引物在5个品种中具有特征带型。用4对引物进行组合鉴定可将9个烟草品种完全区分开，这些标记在烟草品种纯度鉴定中，具有良好的应用前景。