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骨稳态是由成骨细胞调节的骨形成和破骨细胞调节的骨吸收之间相互耦联的动态平衡,骨稳态的失衡可导致多种疾病,如石骨症、骨质疏松症、骨溶解等。骨溶解和骨质疏松症是老龄人群中常见的骨代谢失衡相关疾病,其治疗主要围绕着促进骨形成和抑制骨吸收两个方面进行。负责骨吸收的破骨细胞的形成受两种关键细胞因子M-CSF和RANKL的调控,RANKL与期受体RANK结合后启动一系列下游信号反应,导致单核细胞分化和相互融合成具有骨吸收活性的成熟破骨细胞。PI3K-AKT信号级联是响应RANKL激活的重要通路之一,而PDK1则是PI3K-AKT级联的主要上游脂质激酶,主要功能是通过磷酸化的方式激活AKT,触发级联反应,进一步激活AKT下游的效应因子。然而,PDK1在调控破骨细胞分化和骨吸收过程中的作用尚未明确。目的:探索PDK1基因参与调控破骨细胞分化成熟过程中的分子机制,为治疗骨质疏松症或骨溶解相关疾病寻找新的药物调控靶点。方法:1.利用Cathepsin K启动子驱动的Cre-Lox P系统,构建条件性破骨细胞中PDK1基因敲除小鼠,通过Micro-CT扫描和骨组织切片染色,观察小鼠骨骼表型和破骨细胞活性的变化,分析PDK1基因调控破骨细胞对小鼠骨稳态的影响。2.提取小鼠BMMs,在RANKL和M-CSF刺激下进行体外培养,通过TRAP染色、羟基磷灰石涂层吸收检测、CCK-8法细胞增殖活性检测、TUNEL法细胞凋亡染色,实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹等方法,观察敲除PDK1基因对破骨细胞分化成熟和凋亡的影响,并阐明PDK1调控破骨细胞分化和吸收功能的分子机制。3.在阐明PDK1调控破骨细胞分化和吸收功能的机制的基础上,构建UHMWPE颗粒诱导的颅骨骨溶解和OVX诱导的骨质疏松小鼠模型,通过Micro-CT扫描、ELISA法血清学检测、骨组织切片染色和生物力学检测等方法,观察分析PDK1基因调控破骨细胞对骨稳态失衡的保护效果。4.构建胫骨骨折模型,通过X线摄影、Micro-CT扫描、骨组织切片染色和生物力学检测等方法,观察分析PDK1基因调控破骨细胞对骨折修复影响。结果:1.与WT组小鼠相比,PDK1-c KO组小鼠在宏观上表现出体型发育偏小,类似侏儒的表型。Micro-CT扫描显示,PDK1-c KO组小鼠骨量明显增加,呈现岩骨表型。胫骨组织切片TRAP染色显示,PDK1-c KO组小鼠体内破骨细胞数量显著减少。血清学分析结果显示,PDK1-c KO组小鼠血清骨吸收标志物水平显著降低。而股骨皮质骨钙黄绿素-茜素红荧光标记的基础矿盐沉积速率（MAR）、次级骨化中心出现时间和骨形成标志物水平在两组之间无显著差异。2.提取小鼠BMMs,在体外诱导培养。结果显示,与WT组相比,PDK1-c KO组BMMs分化生成的TRAP阳性破骨细胞数量显著减少,而且吸收羟基磷灰石涂层的能力明显减弱。鬼笔环肽染色发现PDK1-c KO组BMMs形成伪足小体肌动蛋白带的能力降低,相互融合形成多核破骨细胞的能力减弱,破骨细胞中平均细胞核数量显著减少。RT-PCR结果显示,PDK1-c KO组破骨细胞相关基因表达水平显著下降,进一步的蛋白免疫印迹定量分析显示,PDK1-c KO组破骨细胞中PDK1、p-AKT（Thr308）和AKT下游效应因子p-GSK3β和NFATc1的表达水平均显著降低。3.在颅骨骨溶解模型中,血清学分析结果显示,与WT组相比,PDK1-c KO组血清炎症因子TNF-α和IL-1β的表达水平显著降低。Micro-CT扫描显示,PDK1-c KO组小鼠颅骨骨溶解程度较WT组明显减轻,穿孔率和孔隙面积均显著降低。颅骨组织切片TRAP染色显示,WT组颅骨表面聚集大量TRAP阳性破骨细胞,PDK1-c KO组TRAP阳性细胞数量显著减少。在OVX诱导的骨质疏松症模型中,腰椎的Micro-CT扫描结果显示,WT组较PDK1-c KO组骨量显著减少,骨质疏松更加严重。腰椎骨组织切片TRAP染色结果与颅骨骨溶解模型类似,WT组骨小梁表面聚集大量TRAP阳性破骨细胞,而PDK1-c KO组TRAP阳性细胞数量显著减少。腰椎压缩应力测试结果显示,与WT组相比,PDK1-c KO组腰椎的最大应力、弹性模量、压缩位移和能量吸收均明显增加。4.在胫骨骨折模型中,X线摄影和Micro-CT扫描结果显示,与WT组相比,PDK1-c KO组骨桥形成较晚,骨痂吸收和重建延迟。TRAP染色和SO/FG染色结果显示,WT组骨痂中可见大量TRAP阳性破骨细胞聚集,PDK1-c KO组TRAP阳性破骨细胞较WT组显著减少。RT-PCR结果显示,PDK1-c KO组骨痂组织中破骨细胞标志基因的表达量较WT组显著降低,而成骨细胞标志基因的表达量在两组之间无显著差异。生物力学分析结果显示,骨折愈合晚期,PDK1-c KO组骨痂的最大扭矩和扭转刚度较WT组均显著降低。结论:1.PDK1基因通过调控体内破骨细胞的分化和活性来调控骨稳态,进而影响生长期小鼠的骨重建过程和骨组织结构。2.PDK1基因通过AKT-GSK3β-NFATc1信号转导通路,正性调控破骨细胞的分化成熟和骨吸收功能。3.PDK1基因通过调控破骨细胞的分化和吸收活性来调节骨代谢的失衡,有作为治疗骨质疏松症和骨溶解相关疾病的药物靶点的潜在可能。4.PDK1基因的缺失过度抑制破骨细胞的分化,可能会延迟骨痂的吸收和重建,影响骨折修复的进程。