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第一部分超表达STAT4和STAT6稳定Jurkat细胞系的建立目的:构建STAT4及STAT6超表达Jurkat稳定转染细胞系,以便向该细胞系中转染干扰质粒导致STAT4、STAT6和CBP基因沉默,观察转录因子STAT4、STAT6及CBP在Jurkat细胞中的相互效应。方法:使用DMRIE-C分别将质粒pIRES2-EGFP、pIRES2-EGFP-STAT4和pIRES2-EGFP-STAT6转染入Jurkat细胞,并利用质粒编码蛋白中的Neo/Kan酶活性,使用G418筛选出稳定表达STAT4及STAT6的稳定细胞系。结果:①质粒与DMRIE-C最佳比例随细胞接种密度改变而发生变化。②当接种Jurkat细胞为2.5×105/cm~2时,G418 500 mg/ml为合理的稳定筛选浓度。③在G418筛选下,转染质粒pIRES2-EGFP、pIRES2-EGFP-STAT4和pIRES2-EGFP-STAT6的Jurkat细胞,其GFP表达高峰分别在转染后第3~4天、第6~7天和第9天出现。④使用脂质体DMRIE-C转染Jurkat细胞,2.5×105/cm~2组与1.5×10~5/cm~2组转染率相差不大。⑤经G418筛选,1.5×105/cm~2组筛出稳定转染的细胞克隆,但是2.5×10~5/cm~2组未筛出。⑥转染质粒pIRES2-EGFP-STAT6的Jurkat细胞经G418筛选,出现稳定转染的细胞克隆,转染质粒pIRES2-EGFP-STAT6的Jurkat细胞则未筛选出任何克隆。结论:经过DMRIE-C转染和G418筛选,发现了质粒表达的一些特点,获得了稳定筛选的一些经验,转染pIRES2-EGFP-STAT6质粒的Jurkat细胞出现了稳定表达的细胞克隆,但转染STAT4质粒的Jurkat细胞因转染率过低未能筛选出稳定细胞系。第二部分Lipofectamine? LTX转染Jurkat细胞条件的优化目的:优化阳离子脂质体Lipofectamine? LTX转染悬浮细胞Jurkat的条件,以建立更为有效的转染方案。方法:把带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的两种质粒pIRES2-EGFP和pIRES2-EGFP-STAT6作为基因载体,采用Lipofectamine? LTX转染Jurkat细胞,检测细胞转染状态、脂质体与DNA的比例、细胞接种密度、不同量培养基等对转染效果的影响,比较瞬时转染效果。结果:Jurkat细胞生长速度与细胞密度密切相关,转染前1 d换液,可保证细胞的良好生长状态,培养基新鲜度对细胞状态影响不大。Lipofectamine? LTX体积与质粒质量之比为2.75μl:500 ng时,其转染效果明显优于其他各组;适当加大转染时Jurkat细胞的铺板密度,可以明显提高转染试剂的利用率;转染48 h后,300μl/孔组的荧光阳性率是600μl/孔组的(1.4±0.2)倍,差异有统计学意义(P<0.05);转染后24 h,各比例组(按照Lipofectamine(?) LTX体积与质粒质量分组)转染效果差异无统计学意义(P>0.05);转染48 h后,各比例组转染效果差异显著(P <0.05),且Lipofectamine(?) LTX转染两种质粒效果差异有统计学意义(P<0.05)。结论:对Lipofectamine(?) LTX转染悬浮细胞Jurkat做出了一些建设性意见,并阐述了转染后基因的一些表达规律,以期对悬浮细胞的转染提供相关参考。第三部分STAT4、STAT6及CBP相应基因沉默在Jurkat细胞中的相互影响观察目的:利用基因沉默技术,观察由此引起的效应,并分析转录因子STAT4、STAT6及CBP在基因转录之间的相互关系。方法:使用阳离子脂质体Lipofectamine(?) LTX分别将质粒pGenesil-3-shSTAT4、pGenesil-3-shSTAT6或pGenesil-3-shCBP与检测质粒pGL3-IL-4R和pCAT3-IFN-γ共转染入Jurkat细胞,用IL-12和IL-4激活Jak-STATs信号通路,利用荧光素酶报告基因检测试剂和氯霉素乙酰转移酶ELISA试剂盒检测,观察靶基因的活性。结果:基因CBP的沉默可以导致基因IL4R和IFNG启动子活性的下降,统计学分析有意义(P<0.05);基因STAT4和STAT6的沉默所得结果没有统计学意义(P>0.05)。结论:①CBP是启动基因IL4R和IFNG转录的重要辅助分子;②CBP在Jurkat细胞中的表达是有限的;③在人和小鼠细胞中的CBP结构可能高度保守。④转录因子STAT4和STAT6之间的相互关系暂时无法确定。