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背景与目的:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全世界肿瘤相关性死亡的第二大要素,是最常见的原发性肝癌。由于肝癌患者早期症状不显著和早期诊断技术不完备很容易使病程进展为晚期。对于早期肝癌患者而言,手术切除是较好的治疗方式,但对于身体负荷较差和中晚期的患者而言,全身化疗是极为关键的治疗方式。奥沙利铂作为晚期肝细胞癌的一线治疗药物,被广泛应用于晚期肝细胞癌患者的治疗中,但耐药性限制了其在肝细胞癌(HCC)治疗中的有效性。近年来,众多学者在探索肿瘤耐药机制上做了大量工作,发现应用化疗药物后信号通路的异常活化在肿瘤耐药机制中扮演着重要角色。其中PI3K/AKT/mTOR信号通路的异常活化常与HCC患者的存活率降低,化疗药物诱导DNA损伤后的抗凋亡以及化疗耐药有关。在本研究中,我们评估了 PI3K/mTOR双重抑制剂PKI-587对奥沙利铂在肝细胞癌治疗中敏感性的影响。方法:两药联合体外效应研究:运用MTT和克隆形成实验评估两药联合对HCC细胞(HepG2和SK-Hep1)增殖能力的影响;细胞划痕和Transwell实验观察两药联合对细胞迁移能力的影响;间接免疫荧光检测两药联合后DNA断裂点的形成情况;流式细胞术检测细胞周期,以评估两药联合对细胞周期的影响;AnnexinV-FITC/PI/Hoechst33258染色和JC-1染色,经荧光显微镜观察两药联合对HCC细胞线粒体膜电位以及细胞凋亡的影响。两药联合体内效应研究:运用裸鼠荷瘤实验测量用药后肿瘤体积的变化评估两药联合对肿瘤生长的抑制作用。两药联合效应调控分子机制研究:运用免疫印迹实验分别在这两种HCC细胞株(HepG2和SK-Hep1)及其异种移植肿瘤组织中分析PKI-587对奥沙利铂治疗后的调控DNA损伤应答,细胞增殖,克隆形成,细胞周期和凋亡蛋白分子的表达情况的影响。结果:在HCC细胞中,奥沙利铂分别激活了PI3K/AKT/mTOR信号通路和DNA损伤修复途径(非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HR))中关键节点分子,而PKI-587有效抑制了这些分子的活化。在体外,与单独用药相比,奥沙利铂联合PKI-587更明显地抑制了肝癌细胞的增殖活力,并显著抑制了细胞增殖调控分子eIF4EBP1和S6K1的活化;更有效地抑制了肿瘤细胞的迁移能力,并明显下调了细胞迁移调控分子MMP2和MMP9的表达;并通过下调修复蛋白p-DNAPKcs(Ser2056),p-ATM(Ser1981)和 p-ATR(Ser428)的活性,进一步阻抑了肿瘤细胞DSB的修复,增加了 DSB断裂点的产生;同时,显著降低了线粒体膜电位,上调了Bad、Bax、Puma、Cytochrome、Apaf-1的表达,增加了Caspase3、Caspase9、PARP的活性,促进了肝癌细胞通过线粒体途径凋亡。此外,单独使用奥沙利铂将细胞周期阻抑在了 S期,而PKI-587和奥沙利铂联合使用将细胞周期进一步阻抑在了 G0/G1期细胞,并抑制了调控细胞G0/G1期向S期转变的分子p-Rb和cyclin D1的表达。在体内,与单独使用奥沙利铂相比,PKI-587联合奥沙利铂进一步抑制了肿瘤组织的生长,并通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路活化,促进Cytochrome C释放,增加DSB断裂点产生,增强Caspase3、PARP活性从而促进了抗肿瘤作用。结论:在奥沙利铂治疗的HCC细胞中,PI3K/AKT/mTOR信号通路和DNA损伤修复途径被稳定激活。PKI-587通过抑制这两条信号通路来增强HCC细胞对奥沙利铂化疗的敏感性。PKI-587和奥沙利铂的组合可能是提高HCC疗效的有希望的方案。图[20]表[0]参[43]