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急性肾损伤(AKI)是一种常见的全球公共卫生问题,以高死亡率和高患病率为主要特征,但目前仍缺乏AKI的有效防治策略及措施。脓毒血症、缺血再灌注以及肾毒性药物等多种致病因素均可诱导AKI的发生,其中以缺血再灌注(I/R)损伤最为常见。细胞炎症、氧化应激和细胞凋亡等多种因素在缺血再灌注肾损伤的病理生理过程发挥重要作用。Irisin是骨骼肌释放、由112个氨基酸组成的的一种多肽,在多种代谢性疾病中发挥作用,并具有抗细胞炎症反应、抗氧化应激及抗细胞凋亡的作用。我们已经知道Irisin能够调节解偶联蛋白1(UCP1)的表达,但UCP1主要在棕色脂肪组织中表达,而在肾脏高表达的是解偶联蛋白2(UCP2),并且UCP2能够通过改善线粒体功能、抑制细胞凋亡来保护肾脏免于缺血再灌注损伤。然而Irisin是否能调节UCP2的表达,并在缺血再灌注AKI的病理生理过程中发挥作用,仍未阐明。因而本研究针对这一问题进行阐述及研究。本研究旨在探讨Irisin在C57/BL6缺血再灌注(I/R)小鼠模型及肾小管上皮细胞缺氧/复氧(H/R)细胞模型中的保护作用及其潜在机制。第一部分Irisin在缺血再灌注急性肾损伤体内外模型中的作用目的:研究Irisin预处理在小鼠肾脏缺血再灌注损伤及HK-2细胞缺氧复氧损伤中的作用。方法:(1)体内实验:本实验采用C57/BL6雄性小鼠,随机分为4组:假手术+生理盐水组(Sham),假手术+Irisin组(Sham+Irisin),缺血再灌注+生理盐水组(I/R)以及缺血再灌注+Irisin组(I/R+Irisin)。Irisin以100 μg/kg浓度进行腹腔注射,每天一次,连续注射14天后进行I/R造模。之后处死小鼠收集组织及血液样本,并检测小鼠的肾脏功能、肾组织病理学变化,Western Blotting或Elisa法检测IL-6、IL-1β及TNF-α蛋白表达变化。并检测氧化应激相关指标MPO、MDA及SOD的活性。Western Blotting及TUNEL法检测细胞凋亡。通过以上方法以观察Irisin对肾脏缺血再灌注损伤的作用。(2)体外实验:本实验采用人肾小管上皮细胞(HK-2细胞株),随机分为4组:对照组(CTL),对照+Irisin组(CTL+Irisin),缺氧/复氧组(H/R),缺氧/复氧+Irisin组(H/R+Irisin)。采用缺氧3h,复氧3h制作H/R细胞模型。Irisin处理组为:制作H/R模型前以1 μg/ml浓度Irisin处理细胞12h。通过qRT-PCR法检测IL-6、IL-1β及TNF-α mRNA表达水平,Western Blotting法检测细胞凋亡相关蛋白,以观察Irisin对肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤的作用。结果:(1)体内实验表明,Irisin能够抑制I/R损伤时肾小管上皮细胞的细胞炎症、细胞凋亡,并改善细胞氧化应激,从而减轻I/R诱导的肾脏损伤。(2)体外实验结果显示,与对照组相比,H/R能增加HK-2细胞凋亡、促进细胞炎症,而Irisin预处理显著抑制H/R诱导的HK-2细胞炎症因子mRNA表达水平的增加及caspase 3蛋白的活化。结论:在小鼠肾脏I/R模型及体外培养肾小管上皮细胞H/R模型中,细胞炎症、细胞凋亡被激活,增加肾脏损伤。而Irisin预处理能够显著抑制细胞炎症、减轻细胞凋亡、改善氧化应激来发挥肾脏保护作用。第二部分Irisin对缺血再灌注AKI发挥保护作用潜在机制的研究目的:利用体内外实验,阐述Irisin通过调节肾小管上皮细胞中解偶联蛋白(UCP2)的表达而减轻I/R诱导的小鼠肾损伤及H/R诱导的HK-2细胞损伤。并在人肾小管上皮细胞HK-2 H/R模型中研究Irisin调节UCP2表达的潜在生物学机制。方法:(1)体内实验:小鼠分组、处理及样本收集同第一部分。采用Western Blotting法分别检测4组小鼠AMPK活化及UCP2蛋白表达量,以观察Irisin对I/R处理小鼠肾脏pAMPK和UCP2表达的影响。(2)体外实验:本实验采用人肾小管上皮细胞HK-2,细胞培养、分组及Irisin预处理同第一部分。首先通过Western Blotting法分别检测4组细胞UCP2蛋白表达量,以观察Irisin对H/R处理肾小管细胞UCP2表达的影响。之后于Irisin预处理前加入UCP2 siRNA,H/R造模后,利用qRT-PCR检测各组细胞IL-1β及IL-6的变化,并通过流式细胞仪观察各组细胞凋亡的变化。(3)采用人肾小管上皮细胞HK-2,将HK-2细胞分为对照组(CTL),Compound C干预(CC)组,以及Irisin+CC组。AMPK抑制剂Compound C以5μM浓度预处理HK-2细胞30min,之后以等体积溶剂或者Irisin(1μg/ml)处理细胞12h。收集细胞后,Western Blotting检测UCP2蛋白表达及AMPK磷酸化水平。结果:(1)体内实验结果发现,Irisin能够增加I/R损伤时近端小管上皮细胞UCP2及pAMPK的表达。(2)体外实验进一步表明,与对照组相比,H/R处理增加了肾小管上皮细胞中UCP2的表达,而Irisin预处理则进一步增加了 H/R诱导的HK-2细胞UCP2的表达。(3)UCP2敲减增加了 H/R诱导的细胞炎症反应和细胞凋亡,并抵消了 Irisin的肾保护作用。(4)Irisin能促进AMPK磷酸化并呈时间依赖性。(5)与CTL组相比,CC预处理显著抑制了 AMPK的磷酸化,并降低了 UCP2蛋白表达水平,并且AMPK抑制剂CC能显著减弱Irisin对UCP2的上调作用。结论:在小鼠肾脏I/R模型及肾小管上皮细胞H/R模型中,Irisin的肾脏保护作用主要是通过上调肾脏小管上皮细胞UCP2蛋白表达来实现。并且Irisin可能依赖AMPK途径实现对UCP2调节。