华石斛与宿主内生真菌分离、鉴定及相关性研究

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兰科植物(Orchidaceae)是典型的菌根植物,大多数种类具有极高的观赏和药用价值。人为过度采挖和生态环境破坏。其中包括华石斛(Dendrobium sinense)在内的多数热带野生兰科植物都处于濒危灭绝状态。自然环境下,兰科植物种子萌发以及幼苗生长都必须有内生真菌参与。根据前人研究附生兰对宿主植物具有偏好性,其影响因素诸多,如营养、植物激素、真菌等。本研究从真菌角度探索兰花与宿主内生真菌中是否存在影响偏好的共有真菌。为探求华石斛与宿主间的内生真菌相关性,本研究采用野生华石斛个体和根系及相应宿主植物树皮进行真菌分离与纯化,经传统的形态学技术及分子生物学鉴定技术相结合,探讨兰科植物与宿主的内生真菌的关系,从而筛选及鉴定宿主对华石斛有重要作用的内生真菌,并从华石斛内生根茎叶部位分离真菌,按不同季节分析其真菌分布规律。研究采用组织分离法和研磨包埋法对旱季及雨季采集样品进行分离和鉴定。其主要研究结果如下:(1)分离结果:旱季采集材料分离出351株真菌,经纯化归并后为147株。旱季绝大多数采样材料的分离率为71.6%,其中华石斛内生真菌平均分离率为57.0%,成龄根(G)、原球茎(Y)、幼苗根茎叶(SG、SJ、SL)分别为40.4%、20.5%、76.4%、76.7%、70.9%,原球茎的分离率最低;宿主内生真菌平均分离率为89.1%,其中成龄植株宿主(GP)达到100.0%,其次是幼苗宿主植物(SP)为89.5%,原球茎宿主(YP,78%)较低。雨季采集材料分离出385株真菌,经纯化归并后为144株。雨季绝大多数的采样材料的分离率为80.4%,其中华石斛内生真菌平均分离率为81.2%,成龄根(G2)、幼苗根茎叶(SG2、SJ2、SL2)分别为59.3%、80.5%、91.1%、94.1%,成龄根的分离率最低;宿主内生真菌平均分离率为90.7%,成龄根宿主(GP2)较高为93.1%,幼苗宿主(SP2)为88.2%。从最大重现率分析,旱季中华石斛的最大重现率(13.8%)比宿主(12.9%)稍高;而雨季华石斛与宿主的最大重现率分别为20.0%和22.5%,综合比较不同季节采样华石斛与宿主的分离结果,发现宿主的分离效果比华石斛更佳,但比较两者的丰富程度,华石斛的真菌分布比宿主更丰富。(2)形态鉴定。通过形态观察可知旱季的华石斛有7科8属,宿主内生真菌有3科3属,其中共有的科属为曲霉科(Aspergillaceae)曲霉属(Aspergillus sp.)、炭角菌科(Xylariaceae)的轮层炭菌属(Daldinia sp.)和炭垫菌属(Nemania sp.)、肉座菌科(Hypocreaceae)木霉菌属(Trichoderma sp.),其中炭垫菌属(Nemania sp.)和木霉菌属(Trichoderma sp.)为优势属。雨季的华石斛鉴定为4科5属,宿主为4科4属,其中它们共有的科属为丛赤壳科(Nectriaceae)的镰刀孢属(Fusarium sp.)、炭角菌科(Xylariaceae)的炭垫菌属(Nemania sp.)、肉座菌科(Hypocreaceae)的木霉菌属(Trichoderma sp.)和白锈科(Cladosporiaceae)枝孢菌属(Cladosporium sp.),除了枝孢菌属(Cladosporium sp.)外的其他3个属为优势属。综合形态鉴定结果可知旱季雨季华石斛与宿主的共有属为炭垫菌属(Nemania sp.)和木霉菌属(Trichoderma sp.)。(3)分子生物学鉴定。分子生物学鉴定旱季雨季华石斛与宿主的真菌鉴定结果共为24科31属76种。其中旱季所有真菌鉴定有17科29属,雨季为15科21属。具体为旱季的华石斛内生真菌鉴定15科21属,宿主内生真菌9科14属;华石斛内生真菌及其宿主共有11个属,相似度达37.9%,其中有7个属为优势属。雨季华石斛内生真菌鉴定13科18属,其宿主鉴定9科12属,华石斛及其宿主间共有的为9个属,相似度为42.9%,其中有6个属为优势属。分子生物学鉴定比形态更准确。(4)相关性分析。综合形态学及分子生物学鉴定旱季雨季华石斛与宿主真菌共31个属,其中华石斛29个属,宿主为21个属,两者之间有16个属为重叠属,华石斛还有13个独属,宿主有5个独属,由此发现华石斛的菌株分布比宿主中的丰富。在16个共同属中炭角菌属(Xylaria sp.),刺盘孢菌属(Colletotrichum sp.),拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis sp.),木霉菌属(Trichoderma sp.)、炭垫菌属(Nemania sp.)、镰刀菌属(Fusarium sp.)的6个属为优势属。同时经过在属分类水平上的群落结果统计分析,进一步证实这6类真菌在华石斛与宿主中均有分布。由此初步推断这些真菌在华石斛与宿主之间起到“桥梁”的作用。
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