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动物源性医疗器械利用动物组织或其衍生物为主要成分制造而成,具有良好的生物相容性和组织诱导功能,因此在临床上得到了广泛应用。然而动物源材料在引入的同时,也带了人畜共患病毒传播的风险。因此,根据国家标准,动物源性医疗器械临床应用之前应增加病毒去除/灭活工艺,并进行病毒去除/灭活工艺有效性验证。传统的病毒灭活验证方法——细胞培养法,耗时、耗力、耗资,且易受人为误差影响。分子生物学方法如qPCR方法,虽检测速度快,灵敏性高,但是无法区分感染性、非感染性病毒。前处理结合qPCR方法如:酶处理结合qPCR方法以及叠氮溴化丙锭（propidium monoazide,PMA）或叠氮溴化乙锭（ethidium monoazide,EMA）处理结合qPCR方法虽然能在一定程度上解决此问题,但二者均无法为绝大多数病毒灭活方式提供标准化解决方案。虽然细胞培养结合qPCR（integrated cell culture-qPCR,ICC-qPCR）方法的出现使前处理结合qPCR方法在病毒灭活验证中的应用成为可能,但是该方法依然存在需要优化的问题。首先,该方法目前主要用于水环境中病毒的监控,还没有应用于动物源性医疗器械病毒灭活验证;其次,每种病毒所对应的具有理想检测限和定量范围的病毒接种并清洗后的扩增时间不一致,而且目前尚没有针对动物源性医疗器械指示病毒——伪狂犬病毒（pseudorabies virus,PRV）的相关研究;其三,ICC-qPCR方法不能完全消除由高浓度非感染性病毒造成的假阳性信号的影响。因此本研究欲优化PRV病毒接种细胞并清洗后的扩增时间以及其qPCR检测体系以建立常规ICC-qPCR方法;通过对初始样本进行稀释以及接种细胞后清洗的优化来消除样本中高浓度非感染性病毒对常规ICC-qPCR结果的影响;将优化ICC-qPCR方法用于检测由感染性、非感染性病毒混合而成的模拟样本以及动物源性医疗器械病毒灭活样本中的感染性病毒量,并与细胞培养法做对比以验证将其作为细胞培养法的替代方法用于动物源性医疗器械病毒灭活验证的可行性。序列比对结果表明,gB基因区为保守序列;qPCR体系优化结果表明引物8（5’-TCCTCCTTGAGCGTCTTCGT-3’,3’-GTCCTTCCTGTCCAACCCCT-5’）具有最好的扩增效率（94.29%）及特异性,并且结合探针后（5′-FAM-CCGGCCAGCACCAGCAGCCC-BHQ1-3′）可完全消除非特异性扩增的影响。病毒接种细胞并清洗后的扩增时间优化结果显示,当扩增时间为18 h时,ICC-qPCR方法具备较低检测限(低于-0.5 Logs(Log10TCID50/100μL)),但定量范围较窄（-0.5 Logs至2.5 Logs）;当扩增时间为6 h时,ICC-qPCR方法具备较宽定量范围（1.5 Logs至4.5 Logs）,但检测限较高（0.5 Logs）;当扩增时间为12 h时,具备最佳检测限（-0.25 Logs）和定量范围（0.75 Logs至3.75 Logs）。非感染性病毒清洗结果表明,当样本中的非感染性病毒滴度低于2.75 Logs时,在进行常规ICC-qPCR时,检测结果为阴性,不会对实验结果造成较大影响。然而,当样本中的非感染性病毒滴度高于2.75 Logs时,其Ct值均小于35,会对实验结果造成影响,尤其是当非感染性病毒滴度较高时,影响较大。当模拟样本中的非感染性病毒浓度较低时,由常规ICC-qPCR、优化ICC-qPCR测得的感染性病毒滴度分别为4.81、4.87 Logs,与细胞培养法测得的结果（4.75 Logs）高度一致。当模拟样本中的非感染性病毒浓度较高时,由优化ICC-qPCR测得的感染性病毒滴度为1.62 Logs,与细胞培养法测得的结果（1.63 Logs）高度一致,且与常规ICC-qPCR测得的结果（2.00 Logs）存在显著性差异。病毒灭活验证样本检测结果显示,在0 kGy辐照剂量时,由常规ICC-qPCR、优化ICC-qPCR测得的感染性病毒滴度分别为4.82、4.60 Logs,与细胞培养法测得的结果（4.58 Logs）高度一致。在12 kGy辐照剂量时,由优化ICC-qPCR测得的感染性病毒滴度为小于-0.25 Logs,与细胞培养法测得的结果（小于-0.5 Logs）一致,与常规ICC-qPCR测得的结果（2.33 Logs）存在显著性差异;在25 kGy辐照剂量时,由优化ICC-qPCR测得的感染性病毒滴度为小于-0.25 Logs,与细胞培养法测得的结果（-0.5 Logs）一致,与常规ICC-qPCR测得的结果（2.51 Logs）存在显著性差异。综上,本文建立了PRV病毒的常规ICC-qPCR检测方法,并通过在样本接种阶段进行3次连续10倍稀释和病毒吸附后的3次清洗,以及清洗对照组的设置完全消除了非感染性病毒的影响;模拟样本以及实际的动物源性医疗器械病毒灭活样本中感染性病毒滴度检测结果显示,由优化ICC-qPCR测得的结果始终与细胞培养法高度一致,可作为细胞培养法的替代方法应用于动物源医疗器械的病毒灭活验证研究。