抗菌肽CGA-N12具有特异抗热带念珠菌(Candida tropicalis MYA-3404)抗性,能够与合成热带念珠菌细胞壁β-1,6-葡聚糖的KRE9蛋白结合。因此,研究抗菌肽CGA-N12与KRE9蛋白之间的相互作用,对揭示抗菌肽CGA-N12在热带念珠菌上的作用靶点具有重要意义。首先,本研究构建了重组载体pET28a-KRE9,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,经SDS-PAGE和Western Blot分析,纯化得到分子量为35 kDa的融合蛋白KRE9。通过测定单位时间内葡萄糖的消耗量,得知融合蛋白KRE9有较高的酶活性。采用等温滴定量热法(ITC)检测抗菌肽CGA-N12与KRE9蛋白的相互作用,结果表明:相互作用过程为吸热反应;抗菌肽CGA-N12与KRE9之间的作用力主要是疏水作用力;结合位点在抗菌肽CGA-N12与KRE9比为6时达到饱和;N值在l左右,表明抗菌肽CGA-N12与KRE9结合为单个位点的结合模型;结合常数Ka值为1489~2291,表明有较强的相互作用力。为了研究抗菌肽CGA-N12与KRE9蛋白相互作用时的距离,本研究构建了重组载体pETDuet-YFP-CGA-N12、pETDuet-CFP-KRE9和pETDuet-CFP-KRE9-YFP-CGA-N12。通过在大肠杆菌BL21(DE3)胞内进行双基因共表达,借助FV1000激光共聚焦显微镜,采用荧光能量共振转移(FRET)检测抗菌肽CGA-N12与KRE9蛋白的相互作用。结果表明,抗菌肽CGA-N12与KRE9蛋白之间发生了能量转移,供体CFP-KRE9的荧光强度减弱,受体YFP-CGA-N12的荧光强度增强。说明抗菌肽CGA-N12与KRE9在相互作用时,两者之间的距离为7~10 nm。