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[目 的]人类白细胞抗原(Human Leukocyte Antigen,HLA)是诱导移植排斥反应的主要成分,受体免疫细胞对移植物表面HLA抗原识别后可产生针对移植物的抗HLA抗体,有效检出抗HLA抗体是降低移植排斥反应的关键。淋巴细胞交叉配型实验与群体反应性抗体(Panel Reactive Antibody,PRA)实验可判断受体预存抗HLA抗体状况,对预测移植排斥反应发生风险具有重要意义。目前,临床常用的补体依赖性细胞毒实验(Complement Dependent Cytotoxicity,CDC)、ELISA法的PRA实验由于方法学的限制,检测灵敏度较低。在实际工作中,可能会出现假阴性结果,影响移植患者的诊疗。为提高检测方法的灵敏度,本研究建立了基于流式平台的淋巴细胞交叉配型及PRA实验新方法,并在肾移植患者中进行应用。[方 法]1.研究对象及样本来源(1)淋巴细胞交叉配型实验供体标本来自于2019年3月至2020年1月我院器官获取组织(OPO)开展的30例捐献者,受体标本来自同期在我院进行移植手术的48例受体,阴性对照血清来自随机抽取的我院2例AB型男性健康体检人员混合血清,阳性对照血清来自我院20例PRA阳性患者混合血清。(2)PRA实验标本来自于2016年9月至2019年4月门诊及住院患者2947例。2.流式细胞交叉配型(Flow Cytometry Crossmatch,FCXM)实验方法的建立及方法学比对采用密度梯度离心法或免疫磁珠法(负选法)分离供体淋巴细胞,比较两种不同方法分离淋巴细胞的纯度、提取率,选择分离效果更好的方法作为淋巴细胞分离方法。将细胞与受体血清进行孵育,加入anti-CD3-PE、anti-CD19-APC、anti-IgG-FITC等荧光抗体对B淋巴、T淋巴、抗HLA IgG抗体进行识别,通过流式细胞仪对数据进行分析。采集14例供体淋巴细胞及48例受体血清,同时进行FCXM及CDC实验,比较两种方法的一致性。同期,将受体血清按照流式荧光法PRA结果进行分组,比较FCXM及CDC两种方法与PRA结果的符合率。3.流式荧光法检测PRA实验方法的建立及方法学比对将受体血清与吸附有HLA抗原的荧光微球进行孵育,使受体血清中的抗HLA抗体与相应的抗原结合,加入R-藻红蛋白标记的羊抗人IgG抗体,对结合在微球上的抗HLA抗体进行识别,通过Luminex 200对数据进行分析。采集2907例患者血清,其中1142例血清采用ELISA法进行检测,1765例血清采用流式荧光法进行检测。同期抽取40例患者血清,同时采用两种方法进行检测。4.实验数据统计分析采用SPSS V22.0统计学软件进行统计分析,计量资料结果根据数据类型采用t检验、单因素方差分析、卡方检验、Mann-Whitney U检验等方法进行统计分析。计数资料率的组间比较采用卡方检验。配对计数资料采用McNemar检验与Kappa检验。[结 果]1.FCXM实验方法的建立及方法学比对(1)免疫磁珠法(负选法)分离淋巴细胞的纯度、提取率分别为95.1±1.9%、84.1±7.8%,密度梯度离心法分离淋巴细胞的纯度、提取率分别为77.0±9.2%、14.5±7.7%,免疫磁珠法(负选法)纯度、提取率明显高于密度梯度离心法(P<0.01)。(2)FCXM实验T淋巴细胞Anti-IgG-FITC的Cutoff值为222.5,B淋巴细胞 Anti-IgG-FITC 的 Cutoff 值为 210.1。(3)PRA阴性组,CDC与PRA结果一致性为100%(7/7),FCXM与PRA结果一致性为42.9%(3/7);PRA阳性组,CDC与PRA结果一致性为8%(4/50),FCXM 与 PRA 结果一致性为 48%(24/50)。(4)采用FCXM与CDC方法同时进行57次交叉配型实验,CDC阳性的有4例,其中FCXM阳性2例,阴性2例;CDC阴性的有53例,其中FCXM阴性27例,阳性26例。两种方法的一致性较差。(McNemar检验P值<0.01;Kappa 值<0.4)。2.流式荧光法检测PRA实验方法的建立及方法学比对(1)ELISA法 PRAⅠ 类、Ⅱ类及总阳性率分别为 9.0%(103/1142)、8.1%(92/1142)、13.7%(156/1142),流式荧光法分别为 22.9%(404/1765)、21.9%(387/1765)、34.3%(606/1765),流式荧光法阳性率明显高于 ELISA 法(P<0.01)。(2)采用流式荧光法及ELISA法同时对40例患者PRA进行检测,ELISA法PRA阳性的有4例,其中流式荧光法阳性4例,阴性0例;ELISA法PRA阴性的有36例,其中流式荧光法阴性2例,阳性34例。两种方法的一致性较差。(McNemar P 值<0.01;Kappa 值<0.4)。[结 论]1.淋巴细胞分离纯度和提取率,免疫磁珠法(负选法)均高于密度梯度离心法。2.FCXM实验的灵敏度高于CDC实验,实验结果的判读受到实验操作人员主观因素的影响较小,易于标准化。3.PRA实验,流式荧光法检测灵敏度高于ELISA法。流式荧光法检测程序所需时间更短,适用于批量标本检测。