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背景甲状腺癌是近20年来增长最快的实体瘤之一,在内分泌恶性肿瘤中也最常见。过去数十年内,在全世界内其发病率急剧增长,而甲状腺乳头状癌(palillary thyroid carcinoma,PTC)占据全部甲状腺癌的85%～90%。PTC虽然恶性程度较低,可用传统治疗方法治愈,但部分患者在早期就有癌细胞转移到局部淋巴结,致使手术后仍存在肿瘤复发和转移的可能。近年来,长链非编码RNA(long noncoding RNA,lnc RNA)在相关肿瘤中成为研究热点。lnc RNA为非编码RNA分子,其长度大于200nt。之前普遍认为lnc RNA是基因组转录过程中的“噪音”,不编码蛋白质分子,但近期研究发现它具有基因表达调控作用及重要的生物学及病理学功能。它以RNA的形式在表观遗传水平、转录水平以及转录后水平进行调控,并参与X染色体沉默、基因组印迹、染色体修饰、转录激活、转录干扰等多种生命过程,从而调控肿瘤的发生发展机制。此外,尽管许多研究发现lnc RNAs在甲状腺癌中存在着异常表达现象,但有关lnc RNA在甲状腺癌组织和细胞中的表达及功能机制的研究并不多。故讨论甲状腺癌相关lnc RNA在甲状腺癌中发挥的作用,对甲状腺癌的诊断、治疗及预后分析都具有重要意义。目的本课题前期对12对PTC及配对癌旁组织进行二代高通量测序后,获得甲状腺乳头状癌差异性lnc RNA表达谱,在此基础上筛选出PTC特异的目标lnc RNA—NONHSAT029258——分析NONHSAT029258对PTC细胞生物学功能的影响及其可能的作用机制,从而更好的探索NONHSAT029258在PTC诊断、预后和靶向治疗的应用前景。方法(1)对前期测序结果进行数据库更新及筛选后,选出部分差异表达明显(均为上调)的lnc RNA进行验证,我们主要对部分intergenic的lnc RNA进行验证,运用q RT-PCR方法在甲状腺癌各细胞系中的表达水平进行本底检测后,再进行胞质胞核相对表达量的检测,以筛选出目标lnc RNA–NONHSAT029258,再对其染色体定位及组织表达谱进行分析。(2)通过分析The Cancer Genome Atlas(TCGA)公共数据库,验证NONHSAT029258在甲状腺癌以及癌旁组织中的表达。(3)用si RNA转染甲状腺乳头状癌细胞株(TPC-1),下调细胞内lnc RNA的表达后进行下一步的细胞功能学实验(CCK-8、流式以及transwell)。(4)构建目标lnc RNA过表达的慢病毒稳定细胞株(BCPAP),上调细胞内lnc RNA的表达,并通过q RT-PCR验证后,进行下一步细胞功能实验(CCK-8,流式、transwell)。(5)用RNApull-down结合质谱初步研究目标lnc RNA可能在甲状腺乳头状癌中的作用机制。结果(1)NONHSAT029258在各细胞系中的本底表达均较高,且在TPC-1细胞的胞质中相对表达较高,而在BCPAP表达较低,可适用于进行过表达构建。(2)通过对TCGA数据库进行验证,NONHSAT029258在甲状腺癌组织中的表达量高于癌旁组织(P<0.001),与前期二代测序结果相一致。(3)si RNA干扰后,进行细胞功能试验。CCK-8增殖实验提示,下调NONHSAT029258后,甲状腺乳头状癌细胞株TPC-1增殖能力明显下降,后期出现明显凋亡;细胞周期试验中,si-RNA处理细胞后,细胞明显阻滞在G1期,G2期无差异变化,S期细胞比例出现显著的下降(P<0.001);Transwell迁移和侵袭实验提示si-RNA转染后甲状腺乳头状癌细胞的侵袭和迁移能力明显减弱。(4)构建过表达的慢病毒稳定细胞株BCPAP-NONHSAT029258,q RT-PCR验证稳转细胞株的lnc RNA表达量明显高于对照组(P<0.001)。再进一步进行细胞功能实验。CCK-8增殖实验结果提示BCPAP-NONHSAT029258细胞增殖能力增强(P<0.05);流式分析周期结果显示细胞G1期数量下降,S期明显增多(P<0.05);Transwell迁移和侵袭实验提示细胞迁移和侵袭能力明显增强。(5)质谱分析得到可能与lnc RNA相关的蛋白分子后,分析与细胞功能相关的分子以作为进一步分子生物学机制研究。RNApull-down结合质谱,经GO功能聚类分析后,初步表明NONHSAT029258可能通过与cyclin dependent kinase 12(CDK12)、cyclin-H(CCNH)、cdc25C-associated protein kinase 1(MARK3)、P21-and CDKassociated protein 1(BCCIP)或cell division cycle protein16 homolog(CDC16)这5中蛋白分子相作用从而影响甲状腺乳头状癌。结论1、NONHSAT029258在甲状腺乳头状癌组织中高表达。2、NONHSAT029258可能通过调控PTC细胞的周期和迁移侵袭能力促进PTC的进展。3、RNApull-down结合质谱初步表明NONHSAT029258可能通过与CDK12、CCNH、MARK3、BCCIP或CDC16这5种蛋白分子相作用从而影响甲状腺乳头状癌。