论文部分内容阅读
C6挥发物是植物对害虫进行间接防御的关键物质之一，而植物体内的脂氢过氧化物裂解酶（hydroperoxide lyase，HPL）是其合成的关键酶。而有关茶树HPL基因及其与害虫取食间的关系至今未见报道。论文在本课题组前期建立的茶树被茶尺蠖取食诱导前后的cDNA消减杂交文库（SSH）中获得一条与HPL同源性很高的EST （GenBank：GW342656）基础上，对茶树HPL基因进行了cDNA全长克隆、功能鉴定、及其被茶尺蠖取食诱导的表达特征分析。主要结果如下：（1）利用3’/5’-RACE技术从茶树叶片中克隆了一条编码HPL的cDNA全长，其序列长度为1662bp，从起始密码子开始有5个开放阅读框（ORF），其中最长的ORF编码含491个氨基酸的蛋白质，并命名为CsHPL（GenBank：HM440156），其理论分子量和PI分别为54.88kD和8.02，多序列同源比对分析发现其与番石榴的13-HPL（AF239670）同源性最高，为71%；蛋白质保守功能结构域预测分析表明， CsHPL含有细胞色素P450家族中高度保守的4个结构域A、B、C和D，且结构域A(I螺旋区)中保守的苏氨酸被异亮氨酸所代替，结构域D中高度保守的半胱氨酸残基附近有一些特殊的序列NKQAA；进化树分析表明，CsHPL与番石榴的13-HPL等同在一起属于CYP74B亚类。（2）原核表达分析表明，CsHPL基因表达的蛋白分布于上清和包涵体中，结果产生了分子量约为60kD；体外酶促反应结果显示，原核表达的CsHPL只催化13-HPOT底物，而对9-HPOT不表现活性，因此属于13-HPL类型；原核表达的CsHPL最适温度为25℃，最适pH值为7.0。对CsHPL基因的5个不同ORF(Met1, Met5, Met8, Met9和Met15)全部进行了原核表达，结果发现它们各自表达的蛋白都具有HPL活性。（3）利用GC-MS对原核表达的CsHPL催化产物进行了鉴定，结果表明其将底物13-HPOT催化生成的C6挥发物为(z)-3-己烯醛。（4）Southern blot分析表明，CsHPL基因以单拷贝存在与茶树基因组中。（5）qRT-PCR分析表明，两个茶树品种龙井43和舒茶早被茶尺蠖取食后3-9h， CsHPL基因表达量能够明显上升，且达到最大表达量，随后下降，但是其最大表达量和出现的时间存在品种间差异；龙井43在取食后3h CsHPL基因表达量上升至最大值，为对照的13.6倍，而舒茶早则在9h时表达量最大，为对照的3.9倍。对两个品种进行机械损伤后，CsHPL基因的表达呈现类似的规律。