【摘 要】
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本实验室利用转座子突变法从费氏中华根瘤菌}tN01基因组中筛选到一个与硫代谢相关并影响菌株结瘤能力和结瘤时间的基因smrA。通过序列分析发现在smrA的上游有4个转录方向相同
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本实验室利用转座子突变法从费氏中华根瘤菌}tN01基因组中筛选到一个与硫代谢相关并影响菌株结瘤能力和结瘤时间的基因smrA。通过序列分析发现在smrA的上游有4个转录方向相同的基因即ORFa、ORFb、ORFc、ORFd和一个共同的启动子序列,而在该基因的下游是另外一个具有相同转录方向的基因ORFe。在ORFd和ORFe之间也存在可能的启动子序列。本工作的目的一是验证smrA基因是否与其它基因共同组成一个操纵子;二是研究硫对该操纵子表达调控的影响。
首先对两个可能的启动子区域P1和P2的启动子活性进行了研究。根据测序的结果设计引物,通过PCR扩增得到了ORFa的ATG上游297 bp长的P1片段和ORFe上游321 bp长的P2片段。通过融合PCR将这两个片段分别融合到无启动子的gus基因上游。将这两个融合片段插入质粒载体pTR102,通过三亲本结合法导入费氏中华根瘤菌HN01中。对这两个重组根瘤菌进行GUS活性检测以验证导入片段的启动子活性,结果表明P1和P2片段都具有启动子功能,从而说明了smrA基因所在操纵子包括了ORFa、ORFb、ORFc和ORFd,但不包括ORFe。通过研究硫源对P1片段启动子活性的影响发现,在添加有碳源和氮源的MM培养基中,启动子活性最高,而在添加了碳、氮、硫源(硫源分别为Na<,2>SO<,4>、Na<,2>SO<,3>、Na<,2>S<,2>O<,3>和Met)的MM培养基中,启动子活性均有明显降低,推测硫对P1片段的启动子活性有抑制作用。对P1片段进行5’端缺失,得到了四条不同长度的片段,分别包括ORFa上游序列215 bp、143 bp、102 bp、55 bp。通过测定P1片段及其5端缺失片段在含有不同浓度的不同硫源培养基中的活性发现,在100μM硫浓度条件下,甲硫氨酸的抑制作用要显著强于硫酸盐、亚硫酸盐和硫代硫酸盐。ORFa上游143bp序列已经能完全行使启动子功能,而ORFa上游102bp和55bp序列则无启动子活性。
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