目的和意义:鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）是一种对放化疗高度敏感的肿瘤,是东南亚地区发病率较高的一种恶性鼻咽部肿瘤。广东省是我国发病率较高的地区。早期和局部进展期鼻咽癌患者以单纯放疗或放-化疗联合治疗为主。近些年来,EGFR（表皮生长因子受体,Epidermal growth factor receptor）靶向治疗越来越被重视。EGFR是ErbB家族的成员,由一个细胞外结构域、一个跨膜结构域和一个细胞结构域共同组成的结构。内部域,是一种170kda的跨膜受体。胞外区域可以识别并结合相应的配体,胞内部分则具有酪氨酸激酶活性。一旦被激活,EGFR与其他ErbB蛋白家族成员形成二聚体,然后使酪氨酸激酶磷酸化,进而激活如JAK-STAT和PI3K-Akt等信号通路。这些信号最终促进肿瘤的发展和进展。因此,表皮生长因子受体（EGFR）是一种很有价值的肿瘤治疗靶点。越来越多的证据表明,近85%的鼻咽癌患者EGFR过表达与预后不良相关。EGFR的治疗包括单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）抑制剂和反义基因治疗。目前临床上应用EGFR靶向药物（尼妥株单抗/西妥昔单抗）能够竞争性结合EGFR,阻断由EGFR与其介导的下游信号转导通路,从而抑制肿瘤细胞增殖、诱导分化、促进细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成、增强放化疗疗效。然而,分子靶向治疗的确切机制尚不明确。在本课题的前期研究中,我们发现Foxq1能显著促进血管生成拟态（VM）的形成、肿瘤生长和转移,并能被EGFR抑制剂（尼妥珠单抗或厄洛替尼）有效抑制。血管生成拟态是一种新的血液供应系统,由Maniotis等人于1999年在侵袭性人类黑色素瘤中首次提出。它是一种具有高度恶性、侵袭性的肿瘤通过细胞的自我变形和细胞外基质的重塑,从而形成的血管样结构,以满足其自身的血液供应。近年来,VM在多种恶性肿瘤中有报道,它与肿瘤分级、侵袭转移、预后不良有关。VM在许多肿瘤的进展中起着非常重要的作用。也有研究表明VM在头颈部肿瘤中起重要作用,但相关研究不足。基于上述研究基础,我们得出疑问:EGFR在鼻咽癌中促进血管拟态的生物学过程是怎样的?我们注意到在上皮间充质转化（EMT）可能是促进血管生成拟态形成的因素之一。例如,它们之间存在许多共同的调节因子,如缺氧诱导因子（HIF-1α）、血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶（MMPS）等。EMT是上皮细胞在一定因素作用下失去细胞极性,失去紧密的细胞间连接和黏附连接,获得浸润和迁移能力,成为具有形态和特征的间充质细胞的过程。钙粘蛋白（Cadherin）、连环蛋白（Catenin）和波形蛋白（Vimentin）等被认为是EMT的重要标记物。钙粘蛋白是一种细胞表面分子,参与Ca2+依赖的粘附机制。其中E-cadherin是cadherin家族中被研究得最广泛的成员之一,也是一种有效的肿瘤抑制因子。E-cadherin通过调节诸多信号通路在维持上皮表型和调节组织稳态中发挥重要作用。相反,N-cadherin是一种维持EMT的指标,对EMT过程有促进作用,其表达与各种癌症的发生发展有关。钙粘蛋白的细胞质尾部与β-catenin结合,β-catenin又与α-catenin结合,形成Cadherin-Catenin黏附复合物。当E-cadherin表达下调时,β-catenin不再与E-cadherin相互作用,随着E-cadherin水平的降低,β-catenin要么在细胞浆中降解,要么在细胞核中积累并参与转录。波形蛋白（Vimentin）是中间丝（intermediate filament,IF）蛋白家族的主要组成部分,它广泛地存在于正常间质细胞,它的过度表达与肿瘤的生长、侵袭和不良的预后有关。EMT过程中,Vimentin的表达量会升高。EMT已被发现参与某些肿瘤血管生成拟态的形成,如肝癌、胃癌和黑色素瘤。然而,目前尚未有研究明确鼻咽癌血管生成拟态与EMT之间的关系。我们的研究旨在证明EMT是否可以作为桥梁,介导EGFR通路,促进鼻咽癌血管拟态。实验方法:我们采用免疫组化染色的方法检测60例鼻咽癌患者PAS、CD31、Vimentin、E-cadherin的表达,分析EMT与血管生成拟态在鼻咽癌临床资料中的相关性。在3D细胞培养模型中,加入Nimotuzumab后,观察血管生成拟态数量,采用RT-PCR和Western Blot检测血管生成拟态血管数量和EMT指标的表达量。最后,我们利用裸鼠皮下成瘤动物模型,通过免疫组化的办法验证EMT指标和血管生成拟态之间的变化关系。实验结果:1.在鼻咽癌组织中,随着鼻咽癌的进展,VM与EMT呈显著正相关。采用PAS/CD31双填充染色和免疫组化染色对60例鼻咽癌组织的血管生成拟态及EMT相关因子（E-cadherin和Vimentin）进行定量。统计结果显示,随着鼻咽癌的进展,血管生成拟态血管（PAS阳性,CD31阴性）增多,对应于EMT抑制因子（E-cadherin）的减少和EMT促进因子（Vimentin）的增加。对60例鼻咽癌组织进行免疫组化评分。然后按总分期、T分期和N分期对评分进行分组和统计分析。我们发现PAS+/CD31-评分中,中晚期鼻咽癌组织（Ⅲ+Ⅳ）的评分高于早期鼻咽癌组织（Ⅰ期+Ⅱ期）（p<0.001）。同时,E-cad评分中晚期鼻咽癌组织低于早期鼻咽癌组织（p=0.005）,VIM的评分则是晚期鼻咽癌组织高于早期鼻咽癌组织（p<0.001）。以上结果表明,肿瘤分期越晚,EMT和血管生成拟态过程被促进。同时,我们发现鼻咽癌的T分期与N分期有相似的趋势。综上所述,EMT与鼻咽癌组织中血管生成拟态的形成有关。结果提示EMT可能参与了血管生成拟态的形成。2.EGFR抑制剂抑制鼻咽癌细胞VM的形成。为验证EGFR对鼻咽癌细胞血管生成拟态的影响,将尼妥珠单抗加入鼻咽癌细胞株5-8F和CNE1的培养液中,与5-8F和CNE1细胞培养,观察两组细胞形态的变化。我们发现,未加入尼妥珠单抗的细胞株在细胞培养中更容易出现梭形细胞,但使用尼妥珠单抗后,这种线形细胞的数量显著减少。将这些细胞转移到3D培养基中继续培养24h。我们观察到,与未加入Nimotuzumab的细胞相比,加入了 Nimotuzumab的5-8F和CNE1细胞株形成血管生成拟态结构的能力显著降低。采用Western blot法检测EGFR及其磷酸化产物（p-EGFR）。加入尼妥珠单抗后,EGFR的表达没有明显变化,但两株细胞中p-EGFR的含量明显下降（p<0.05）。这表明尼妥珠单抗通过抑制EGFR磷酸化降低了 NPC细胞形成血管生成拟态的能力。3.在体外细胞实验中,EMT与鼻咽癌细胞株VM形成能力相关。为了在体外细胞实验中评价EMT与血管生成拟态之间的关系。采用qRT-PCR和Western blot检测加入尼妥珠单抗前后EMT相关因子E-cadherin、Vimentin、N-cadherin和β-catenin的变化。我们发现,尼妥珠单抗的加入使E-cadherin的表达增加,而Vimentin等因子的表达减少。EMT过程受到限制。我们还设计了浓度梯度实验,采用qRT-PCR和Western blot检测5-8F和CNE1细胞株在依次浓度递增的加入尼妥珠单抗的培养基中EMT相关因子E-cadherin和血管生成拟态相关因子Ve-cadherin的表达水平。随着尼妥珠单抗在细胞培养液中浓度的增加,E-cadherin的表达水平呈上升趋势,而Ve-cadherin呈下降趋势。综上所述,在体外,在细胞培养液中使用EGFR抑制剂（Nimotuzumab）治疗后,观察细胞形态、血管生成模拟能力以及EMT相关因子的变化,提示EMT与血管生成拟态的形成有关。4.在体内动物实验中,尼妥珠单抗能抑制鼻咽癌细胞株EMT过程与VM形成能力。在我们前期的研究中,为了探讨血管生成拟态与Foxq1和EGFR之间的关系,我们进行了皮下肿瘤发生实验。我们采用BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型（n=6/组）。BALB/c裸鼠皮下注射正常5-8F细胞和Foxq1稳定过表达的5-8F细胞。然后我们将皮下注射过表达Foxq1的5-8F细胞的BALB/c裸鼠分成两组,分别给予尼妥珠单抗和生理盐水治疗。我们继续使用先前保存的肿瘤组织切片进行实验。在本研究中,我们收集这些肿瘤组织进行免疫组化染色和PAS/CD31双染色。对染色结果进行免疫组化评分。我们发现,与普通的5-8F细胞形成的肿瘤组织相比,经过Nimotuzumab处理的小鼠肿瘤组织更不容易形成血管生成拟态。E-cadherin（p<0.05）表达上升,Vimentin（p<0.05）表达降低,提示EMT促进血管生成拟态的过程受到Nimotuzumab的抑制。结论:EMT可能是血管发生拟态的生物学基础。EGFR信号通路促进EMT影响鼻咽癌血管生成拟态。