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家禽呼吸道病原是世界范围内家禽发病和死亡的主要原因,常见的有禽流感病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、新城疫病毒、大肠杆菌、支原体等,其中病毒性疾病导致发生急性和高度接触性感染,对经济影响最重要。与单个病原感染相比,多种病原混合感染在家禽很常见,并导致更严重的临床症状,如气管堵塞、呼吸困难等。低致病性H9N2亚型禽流感病毒在我国鸡群中广泛流行,当与其他呼吸道病原体,特别是与IBV、ILTV等呼吸道病原共感染,可加重H9N2感染而且死亡率差异大。IBV有多种血清型,缺乏交叉免疫,保护效果差,经常导致免疫失败。传染性喉气管炎近年来也在鸡群中时有发生。这些病原体对养禽业具有重要意义,并具有巨大的经济影响,因为它们能够单独或与其他禽类病原体混合感染诱发疾病。目前已经开发出许多用于检测禽呼吸道病毒的荧光定量PCR方法,为从事禽呼吸道病毒感染诊断的人们提供了参考。但是,这些检测方法大多数都只能检测一种病毒,并且不同方法的反应条件也不尽相同。因此,迫切需要一种检测多种重要病原体的可靠的多重荧光定量PCR方法,以用于检测未知样品。本研究旨在建立一种用于检测H9N2 AIV、IBV和ILTV的三重TaqMan荧光定量PCR方法,可同时快速检测H9N2AIV、IBV、ILTV三种病毒,并在2019年从我国17个省份发生呼吸道疾病鸡群采集病料样品660份,应用建立的方法进行了三种病原的临床样品检测。1.H9N2 AIV、IBV和ILTV TaqMan三重荧光定量PCR检测方法的建立H9N2AIV、IBV和ILTV可引起家禽呼吸道疾病,因其临床表现相似,三者之间或与其它病原体常发生混合感染,临床诊断容易混淆。本研究中,我们建立了 一 种三重实时荧光定量 PCR(real-time fluorescence quantification PCR,RT-qPCR)检测方法来直接检测3种病毒。该方法以H9N2的HA基因、IBV的5’非编码区和ILTV的ICP4基因为靶基因,设计引物和TaqMan探针。重组质粒标准品10倍倍比稀释(5×100～5×109copies/μL)分析RT-qPCR灵敏度,单检测具有理想的R2值和效率,检测灵敏度较高。H9AIV、IBV和ILTV的检测限分别在50、500和500copies/反应。批内和批间具有相对较小的变异值,可重复性良好。RT-qPCR具有极好的特异性,与阴性样本或其它常见禽病毒没有交叉反应。H9N2AIV、IBV和ILTV的探针使用不同荧光标记(FAM、HEX和Cy5),可以同时检测这三种病毒。三重RT-qPCR的R2值、PCR扩增效率和较小的批内和批间变异性与单检测具有可比性。这是首次使用三重RT-qPCR对气管和肺混合样品或棉拭样品同时检测H9N2、IBV和ILTV,并且三重RT-qPCR的检测限与单检测方法相同。因此,该方法节省了时间,可提供定量结果且三者之间没有交叉反应。本文建立的三重RT-qPCR检测方法可用于单或三重检测,适用于大批量检测,且具有可靠的灵敏度和特异性,有望对这三种常见的病毒进行监测。2.TaqMan三重荧光定量PCR方法在临床样品检测中的应用从我国江苏、山东、河北等17个省份共采集了 660份临床样品,样品处理后,用建立的TaqMan三重荧光定量PCR的方法进行三种病原的检测病毒的核酸。其中总检出率IBV最高(30.91%),其次为ILTV(19.39%)和H9AIV(14.7%)。H9和IBV、H9和ILTV、IBV和ILTV混合感染的检出率分别为4.39%、3.79%和8.03%,3种病原共感染的检出率为1.21%。时间分布上,一年四季均可发病,但是12月份混合感染的检出率最高,IBV和ILTV、H9N2 AIV和ILTV、H9N2AIV和IBV的共感染率分别为21.52%、10.13%、4.22%,三种病原混合感染率为3.38%。根据宿主分布特点来看肉鸡3种病原的检出率均比蛋鸡高,尤其是IBV,检出率高达54.07%。根据其地域分布规律,可看出江苏、山东、河北的病原检出率较高,当然,这也可能与各省的采样量不均匀有关。综上所述,H9AIV、IBV、ILTV在我国养禽业中依然盛行,应当做好流行病学监测,为疾病的预防控制指明方向。本研究建立的三重检测方法在临床上进行疾病的诊断和流行病学调查中具有快速、特异性强等优点,为疾病诊断和流行病学监测提供了一个有力的技术支持。