神经元缺血再灌注损伤是急性缺血性脑卒中重要的病理生理过程，其中涉及氧化应激、炎症反应、钙超载、兴奋性氨基酸毒性作用等。探索神经元缺血再灌注损伤的有效保护机制，为临床治疗缺血性脑卒中提供新思路，是目前该领域研究的重点。P-糖蛋白属ATP结合盒转运蛋白超家族。在中枢神经系统，其主要分布于血脑屏障毛细血管内皮细胞膜腔面，主要功能是介导物质或者药物外排，避免细胞内异常物质蓄积。在脑缺血、癫痫等疾病中，P-糖蛋白出现表达上调，在神经元、神经胶质细胞中亦可表达。这种表达水平变化的机制及病理生理意义尚不明确。因此，本课题旨在探讨神经元氧糖剥夺损伤中P-糖蛋白的表达水平变化及其对神经元损伤的影响。第一部分P-糖蛋白在神经元氧糖剥夺损伤中的表达目的：探讨P-糖蛋白在神经元氧糖剥夺损伤后表达水平的变化。方法：以小鼠原代皮层神经元体外培养为研究工具，建立神经元氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型。根据OGD/R后培养时间的不同，实验分为四组：Control组、OGD/R6h组、12h组、24h组。以MTT法检测各组神经元活力值的变化趋势；运用Real-timePCR检测ABCB1a、ABCB1b mRNA表达水平；以P-糖蛋白抗体免疫荧光标记检测P-糖蛋白在神经元的表达以及平均荧光强度变化。结果：本部分实验成功建立了小鼠原代皮层神经元体外培养模型以及神经元OGD/R模型。MTT法检测表明，OGD/R6h组、12h组、24h组神经元活力显著下降。Real-time PCR检测表明，ABCB1b mRNA相对表达量平均值在12h组最高（2.13±0.25，P﹤0.05），6h组、24h组无显著差异；各组均未能检测到ABCB1a mRNA的表达。免疫细胞化学检测在6h组、12h组、24h组神经元均可见较明显的绿色荧光标记，以12h组最为明显，平均荧光强度值最高；24h组平均荧光强度反而低于12h组（48.47±9.58VS62.8±8.14，P﹤0.05）；Control组几乎看不到任何绿色荧光标记。结论：1、神经元OGD/R模型能够用于P-糖蛋白的研究。2、P-糖蛋白在神经元氧糖剥夺损伤后mRNA水平与蛋白水平均表达上调，以OGD/R12h表达上调最明显。氧糖剥夺损伤是P-糖蛋白在神经元表达上调的因素。第二部分P-糖蛋白对神经元氧糖剥夺损伤的影响目的：探讨P-糖蛋白表达量的变化与神经元凋亡程度、凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3之间的关系。方法：在神经元OGD/R模型建立的基础上，以第三代P-糖蛋白抑制剂Tariquidar（TQD）为预处理因素。其中，运用MTT法筛选TQD的合适工作浓度。实验分为Control组、OGD/R组、TQD+OGD/R组。Real-time PCR检测各组ABCB1b、Bcl-2、Bax、Caspase-3mRNA相对表达量平均值，免疫细胞化学方法标记P-糖蛋白以及Bcl-2、Bax、Caspase-3在各组神经元的表达并检测平均荧光强度。Western Blot技术检测P-糖蛋白以及Bcl-2、Bax、Caspase-3的相对光密度。AnnexinⅤ-FITC/PI双标流式细胞检测各组神经元凋亡程度。结果：1、P-糖蛋白表达变化：Real-time PCR检测表明，OGD/R组与TQD+OGD/R组ABCB1b mRNA相对表达量平均值无显著差异（2.13±0.25vs1.81±0.50，P﹥0.05）。免疫细胞化学标记P-糖蛋白表明，TQD+OGD/R组平均荧光强度较OGD/R组显著降低（40.13±6.76vs59.46±5.72，P﹤0.05）。Western Blot检测表明，TQD+OGD/R组P-糖蛋白相对光密度值较OGD/R组显著降低（0.23±0.06vs0.69±0.11，P﹤0.05）。结果表明，加用TQD抑制后，P-糖蛋白仅在蛋白表达水平出现表达量下降，而mRNA表达水平未受显著影响。2、Bcl-2与Bax表达变化：Real-time PCR检测表明，Bcl-2mRNA相对表达量平均值TQD+OGD/R组较OGD/R组降低（4.81±2.68vs13.46±2.90，P﹤0.05），而BaxmRNA相对表达量平均值TQD+OGD/R组较OGD/R组增高（7.96±2.85vs5.47±2.15；P﹤0.05）；免疫细胞化学标记检测表明，Bcl-2平均荧光强度TQD+OGD/R组较OGD/R组降低（12.79±3.22vs5.64±2.60，P﹤0.05），而Bax平均荧光强度TQD+OGD/R组较OGD/R增高（15.47±2.16vs11.13±2.17，P﹤0.05）；Western Blot检测表明，Bcl-2相对光密度值TQD+OGD/R组较OGD/R组降低（0.37±0.16vs0.58±0.09，P﹤0.05），Bax相对光密度值TQD+OGD/R组较OGD/R组增高（0.52±0.03vs0.35±0.13，P﹤0.05）。结果表明，在神经元OGD/R模型加用TQD预处理后，Bcl-2表达量减低而Bax表达量增加，Bcl-2/Bax减小，促凋亡因素占据主导地位。3、Caspase-3表达变化：Real-time PCR检测表明，Caspase-3mRNA相对表达量平均值TQD+OGD/R组较OGD/R组显著增加（8.30±1.89vs4.30±1.51，P﹤0.05）；免疫细胞化学标记平均荧光强度检测表明，TQD+OGD/R组较OGD/R组显著增强（32.63±3.94vs22.47±2.76，P﹤0.05）；Western Blot检测表明，TQD+OGD/R组Caspase-3相对光密度值较OGD/R组增高（0.90±0.03vs0.62±0.08，P﹤0.05）。结果表明，加用TQD预处理后，Caspase-3表达量增加，神经元损伤加重。4、AnnexinⅤ-FITC/PI双标流式细胞检测：TQD+OGD/R组早期凋亡细胞、晚期凋亡坏死的神经元比例较Control组、OGD/R组均显著增加（P﹤0.05）。结论：1、TQD可有效抑制P-糖蛋白在神经元的表达。2、加用TQD抑制P-糖蛋白后加重神经元凋亡程度。3、P-糖蛋白在神经元氧糖剥夺损伤中可能起保护作用。