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背景:缺血性脑卒中是全球死亡率的第二大原因。系统研究脑缺血的治疗和机制需要一个稳定的、可复制性高的全脑缺血模型。尽管在许多研究模型中使用小鼠和沙鼠,但是可靠的全脑缺血大鼠模型也是实验所需要的,并且有待进一步改善。四血管阻断法是一种广泛使用的全脑缺血模型。手术需要灼烧大鼠寰椎的翼状孔,永久性阻断双侧椎动脉。但是,术者往往无法直视下电凝椎动脉使其完全闭塞。因此,建立成功的模型需要依赖观察大鼠的翻正反射和脑电图表现。本课题需要建立一种稳定的全脑缺血模型,为后续实验打好基础。血脑屏障是血浆与脑细胞之间的屏障,对中枢神经系统的内稳态和正常功能的维持至关重要。血脑屏障内皮细胞的功能和形态与非脑组织毛细血管内皮细胞截然不同。在许多神经系统疾病中,血脑屏障的完整性会遭到破坏,例如缺血性脑卒中。脑缺血对血脑屏障的损伤作用已被广泛研究。脑缺血缺氧会引起脑内一系列的分子变化,导致内皮细胞紧密连接破坏,血脑屏障通透性增加。许多研究证明脑缺血后雌激素可通过阻止血脑屏障的破坏从而保护脑组织。雌激素的脑保护作用是由雌激素受体介导的(ERα、ERβ、GPER-1)。有研究表明ERα和ERβ可介导雌激素对脑缺血后血管内皮细胞连接蛋白的保护作用。但是,GPER-1在脑缺血导致的血脑屏障损伤中的作用目前还不清楚。目的:1.探索大鼠椎动脉与颈椎的位置关系,寻找阻断大鼠椎动脉的最佳部位。2.建立稳定性高的新型全脑缺血模型,探索最佳缺血时间和最佳缺血部位。3.探索全脑缺血对去势大鼠海马CA1区血脑屏障以及GPER-1和VEGF-A表达的影响。4.探索激动GPER-1受体是否可通过降低VEGF-A表达来保护全脑缺血大鼠CA1区血脑屏障。方法:1.采用CTA、DSA、血管乳胶灌注法明确大鼠椎动脉走行以及与颈椎的解剖关系。寻找阻断大鼠椎动脉的最佳部位。2.建立新型全脑缺血模型。根据全脑缺血10、20、30分钟后大鼠的存活率,得出大鼠全脑缺血的最佳持续时间。随后进行灌注、固定、取脑,采用尼氏染色和TUNEL标记染色法观察脑缺血后大鼠各个脑区神经元的死亡情况,评估新型全脑缺血模型的稳定性。最后根据大鼠神经功能评分量表和胶带实验结果,观察全脑缺血大鼠的行为学变化,进一步评估模型对大鼠行为学的损害情况。3.采用Western blot实验技术观察全脑缺血20min后大鼠CA1区血脑屏障通透性的变化(Ig G漏出率)和连接蛋白(Occludin、Claudin-5)的表达变化。同时也对脑缺血后的CA1区GPER-1受体和VEGF-A蛋白的表达变化进行观察。4.采用Western blot和免疫荧光双标染色观察激动GPER-1受体对全脑缺血后大鼠CA1区血脑屏障通透性(Ig G漏出率)和连接蛋白(Occludin、Claudin-5)表达的影响。随后采用Western blot和免疫组织化学染色法探索激动GPER-1受体是否可通过降低VEGF-A表达来保护全脑缺血大鼠CA1区血脑屏障。结果:1.CTA、DSA、血管乳胶灌注法结果发现,在颈1-颈2横突间隙内椎动脉位于枢椎上关节突的外侧深面,并且不受上关节突遮挡,颈后路手术可以在显微镜直视下轻松阻断椎动脉。2.生存分析结果显示:10min全脑缺血大鼠术后7天的生存率达93%;20min全脑缺血大鼠术后7天的生存率达80%;30min全脑缺血大鼠术后7天的生存率仅为50%。制定20min为新型全脑缺血模型的最佳缺血时间。3.尼氏染色结果显示:20min全脑缺血大鼠CA1区神经元数量在术后第1天无统计学差异,但在术后第3天出现明显下降。在随后的3-7天中,CA1区神经元数量没有进一步下降。制定CA1区为新型全脑缺血模型的最佳缺血部位。4.胶带实验和TUNEL染色结果证明全脑缺血大鼠在术后7天内皮层区和纹状体区神经元均存在凋亡。新型全脑缺血模型可以导致大鼠运动整合能力相关脑区神经元损伤,并且这些神经元的损伤可以通过胶带实验进行观察评价。5.Western blot检测结果显示:全脑缺血大鼠CA1区Occludin和Claudin-5蛋白含量在缺血后6小时开始降低,24小时明显降低。后续实验可以采用全脑缺血后24小时为观察时间点。6.Western blot和免疫荧光双标染色结果显示:激动GPER-1受体可以阻止缺血后OVX大鼠CA1区连接蛋白表达(Occludin和Claudin-5)的下降。另外还发现给予G-1激动剂后全脑缺血OVX大鼠CA1区VEGF-A表达明显下降。结论:1.新型全脑缺血模型可以稳定的造成大鼠海马CA1区神经元迟发性死亡,并引起大鼠神经功能出现异常。20min的全脑缺血为最佳缺血时间,CA1区为最佳缺血部位。2.新型全脑缺血模型可以导致大鼠海马CA1区血脑屏障的破坏,并且在缺血后24小时,CA1区血脑屏障破坏最为明显。3.激动GPER-1受体可在脑缺血早期起到稳定血脑屏障通透性的作用。激动GPER-1受体可以通过减少VEGF-A的表达来稳定缺血CA1区血脑屏障的通透性。