论文部分内容阅读
免疫检查点程序性死亡受体(programmed cell death protein 1，PD-1)及其配体(programmed cell death protein ligand 1，PD-L1)在肿瘤微环境的影响下结合，能抑制T细胞的肿瘤杀伤功能。因此，阻断PD-1与PD-L1的相互作用是对抗肿瘤的免疫抑制作用和激活肿瘤免疫应答的有效手段。PD-L1在多种肿瘤细胞表面高表达，因而在不影响T细胞的正常免疫功能下可作为理想的免疫抗肿瘤靶点。目前，已上市的PD-L1单克隆抗体抑制剂虽然具有较好的疗效，但因其较高的特异性有时会造成严重的免疫相关不良反应，且具有生产成本高、稳定性较差等缺点，因此开发具有PD-L1抑制作用的小分子化合物具有重要意义。为此，本研究通过构建药效团模型并利用分子对接技术，对中药成分及上市药物进行筛选，并对筛选得到的候选化合物进行了PD-L1相互作用评价、体内外抗肿瘤作用和免疫激活作用的考察，最终获得了小分子PD-L1抑制剂阿尼芬净。本论文共分为以下五部分：
1.综述
本章围绕PD-1/PD-L1、基于计算机的药物虚拟筛选技术以及生物分子相互作用的测定方法进行综述。首先回顾了PD-1/PD-L1的功能和作用机制、PD-1/PD-L1抑制剂的国内外研究进展，然后介绍了药效团模型和分子对接等计算机虚拟筛选技术及其常用软件，以及在药物虚拟筛选中的应用，最后介绍了生物分子间相互作用的测定方法及其应用。本章所介绍的国内外研究进展，将为本研究提供理论、数据和方法学基础，有利于本研究的顺利开展。
2.基于药效团模型的PD-L1小分子抑制剂的筛选
本章通过构建药效团模型对PD-L1小分子抑制剂进行初步筛选。首先以32个结构多样的已知PD-L1小分子抑制剂为训练集构建药效团模型，并使用训练集和30个已知PD-L1抑制剂构成的测试集进行性能测试，随后利用已知PD-L1小分子抑制剂与PD-L1相互作用晶体结构的药效特征对药效团模型进行验证，得到最优药效团模型LB-2(包含5个药效特征RHHda)。其次，利用LB-2对收集得到的3906个小分子化合物(包括1876个中药小分子化合物成分和2030个已上市小分子药物)进行筛选，最终得到460个与药效特征相匹配的化合物，作为PD-L1小分子抑制剂的候选化合物。
3.基于分子对接的PD-L1小分子抑制剂的筛选
本章利用分子对接对PD-L1小分子抑制剂进行进一步筛选。首先通过人源PD-L1分别与PD-1、PD-L1单克隆抗体以及小分子抑制剂的复合晶体结构，确定了PD-L1小分子抑制剂的活性中心，即16个活性残基：Phe19、Thr20、Asp26、Ile54，Tyr56、Glu58、Glu60、Asp61、Gln66、Arg113、Met115、Ala121，Asp122，Tyr123、Lys124和Arg125，并将16个活性残基涉及的21对相互作用作为抑制剂的筛选条件。随后，通过全原子对接，并按照结合能＜-7.5kcal/mol且与PD-L1上发生相互作用的残基≧3的标准筛选得到247个化合物。分别以PD-L1单体和PD-L1双链蛋白为受体，指定活性中心为对接位点对247个小分子化合物进行进一步筛选，以结合自由能＜-7.5kcal/mol、相互作用残基数目≧5以及相互作用的空间构象为标准，最终筛选出中药小分子成分单宁酸和上市药物阿尼芬净作为PD-L1小分子抑制剂候选化合物。
4.候选化合物的体外抗肿瘤作用及与PD-L1的体外相互作用评价
本章通过使用体外肿瘤细胞活性实验分别考察单宁酸和阿尼芬净的抗肿瘤作用。首先使用人肺腺癌细胞A549和小鼠肺癌细胞LLC考察不同浓度下单宁酸和阿尼芬净的抑瘤活性，CCK-8试剂盒检测结果显示，在200μg/mL的最高给药剂量下，单宁酸作用下的肿瘤细胞存活率仍在80%以上，抗肿瘤效果不明显，其原因可能是单宁酸本身不具备直接杀伤肿瘤作用，而单纯的肿瘤细胞实验不能有效激活免疫系统抗肿瘤。而阿尼芬净对A549和LLC的IC50分别是170.6和160.9μg/mL，说明阿尼芬净具有一定的直接抗肿瘤效果。随后，使用生物膜干涉技术，对PD-L1与阿尼芬净的结合能力进行考察，测定结果表明PD-L1与阿尼芬净的相互作用亲和力常数KD=7.69×10-5M，表明二者具有良好的结合能力，且结合速率常数kon1/(Ms)=4.08×102，解离速率常数kdis1/s=3.14×10-2，表明二者呈现快结合快解离的动力学过程。由此可见，阿尼芬净具有直接抗肿瘤作用，且可能是潜在的PD-L1抑制剂，因此将阿尼芬净作为候选抑制剂进行后续研究。
5.候选化合物的体内免疫抗肿瘤活性评价
本章通过构建LLC-荷瘤小鼠模型，检测阿尼芬净对血清和肿瘤组织中免疫因子水平的影响，对其体内免疫抗肿瘤活性进行评价。首先对阿尼芬净的体内抗肿瘤作用进行考察，结果显示阿尼芬净中等剂量(25mg/kg)、高剂量(50mg/kg)组、单克隆抗体阳性对照组(Durvalumab，1.25mg/kg)和化药组(5-FU，25mg/kg)的小鼠肿瘤体积和瘤重较模型组显著降低，且阿尼芬净中、高剂量组小鼠去瘤体重较模型组和化药组升高，表明阿尼芬净具有显著体内抗肿瘤活性，且与一般化药相比对小鼠体重影响较小。ELISA实验结果表明阿尼芬净给药组与阳性对照组的血清IFN-γ和IL-4浓度均显著高于模型组与化药组(P＜0.05)。同时，肿瘤组织切片经免疫组化染色结果显示阿尼芬净中、高剂量组和阳性对照组的IFN-γ和GZMB表达显著高于模型组和化药组(P＜0.05)，表明阿尼芬净具有体内免疫激活的作用。
综上所述，本研究通过基于药效团模型和分子对接技术的虚拟筛选、化合物-靶点相互作用验证、体内外抗肿瘤活性和免疫激活作用的考察，成功筛选得到了具有PD-L1抑制功能的免疫抗肿瘤小分子化合物阿尼芬净，丰富了PD-1/PD-L1小分子抑制剂研究，为肿瘤免疫治疗提供了新的选择，也为其他免疫检查点小分子抑制剂和其他靶向小分子药物的开发提供了方法借鉴。
1.综述
本章围绕PD-1/PD-L1、基于计算机的药物虚拟筛选技术以及生物分子相互作用的测定方法进行综述。首先回顾了PD-1/PD-L1的功能和作用机制、PD-1/PD-L1抑制剂的国内外研究进展，然后介绍了药效团模型和分子对接等计算机虚拟筛选技术及其常用软件，以及在药物虚拟筛选中的应用，最后介绍了生物分子间相互作用的测定方法及其应用。本章所介绍的国内外研究进展，将为本研究提供理论、数据和方法学基础，有利于本研究的顺利开展。
2.基于药效团模型的PD-L1小分子抑制剂的筛选
本章通过构建药效团模型对PD-L1小分子抑制剂进行初步筛选。首先以32个结构多样的已知PD-L1小分子抑制剂为训练集构建药效团模型，并使用训练集和30个已知PD-L1抑制剂构成的测试集进行性能测试，随后利用已知PD-L1小分子抑制剂与PD-L1相互作用晶体结构的药效特征对药效团模型进行验证，得到最优药效团模型LB-2(包含5个药效特征RHHda)。其次，利用LB-2对收集得到的3906个小分子化合物(包括1876个中药小分子化合物成分和2030个已上市小分子药物)进行筛选，最终得到460个与药效特征相匹配的化合物，作为PD-L1小分子抑制剂的候选化合物。
3.基于分子对接的PD-L1小分子抑制剂的筛选
本章利用分子对接对PD-L1小分子抑制剂进行进一步筛选。首先通过人源PD-L1分别与PD-1、PD-L1单克隆抗体以及小分子抑制剂的复合晶体结构，确定了PD-L1小分子抑制剂的活性中心，即16个活性残基：Phe19、Thr20、Asp26、Ile54，Tyr56、Glu58、Glu60、Asp61、Gln66、Arg113、Met115、Ala121，Asp122，Tyr123、Lys124和Arg125，并将16个活性残基涉及的21对相互作用作为抑制剂的筛选条件。随后，通过全原子对接，并按照结合能＜-7.5kcal/mol且与PD-L1上发生相互作用的残基≧3的标准筛选得到247个化合物。分别以PD-L1单体和PD-L1双链蛋白为受体，指定活性中心为对接位点对247个小分子化合物进行进一步筛选，以结合自由能＜-7.5kcal/mol、相互作用残基数目≧5以及相互作用的空间构象为标准，最终筛选出中药小分子成分单宁酸和上市药物阿尼芬净作为PD-L1小分子抑制剂候选化合物。
4.候选化合物的体外抗肿瘤作用及与PD-L1的体外相互作用评价
本章通过使用体外肿瘤细胞活性实验分别考察单宁酸和阿尼芬净的抗肿瘤作用。首先使用人肺腺癌细胞A549和小鼠肺癌细胞LLC考察不同浓度下单宁酸和阿尼芬净的抑瘤活性，CCK-8试剂盒检测结果显示，在200μg/mL的最高给药剂量下，单宁酸作用下的肿瘤细胞存活率仍在80%以上，抗肿瘤效果不明显，其原因可能是单宁酸本身不具备直接杀伤肿瘤作用，而单纯的肿瘤细胞实验不能有效激活免疫系统抗肿瘤。而阿尼芬净对A549和LLC的IC50分别是170.6和160.9μg/mL，说明阿尼芬净具有一定的直接抗肿瘤效果。随后，使用生物膜干涉技术，对PD-L1与阿尼芬净的结合能力进行考察，测定结果表明PD-L1与阿尼芬净的相互作用亲和力常数KD=7.69×10-5M，表明二者具有良好的结合能力，且结合速率常数kon1/(Ms)=4.08×102，解离速率常数kdis1/s=3.14×10-2，表明二者呈现快结合快解离的动力学过程。由此可见，阿尼芬净具有直接抗肿瘤作用，且可能是潜在的PD-L1抑制剂，因此将阿尼芬净作为候选抑制剂进行后续研究。
5.候选化合物的体内免疫抗肿瘤活性评价
本章通过构建LLC-荷瘤小鼠模型，检测阿尼芬净对血清和肿瘤组织中免疫因子水平的影响，对其体内免疫抗肿瘤活性进行评价。首先对阿尼芬净的体内抗肿瘤作用进行考察，结果显示阿尼芬净中等剂量(25mg/kg)、高剂量(50mg/kg)组、单克隆抗体阳性对照组(Durvalumab，1.25mg/kg)和化药组(5-FU，25mg/kg)的小鼠肿瘤体积和瘤重较模型组显著降低，且阿尼芬净中、高剂量组小鼠去瘤体重较模型组和化药组升高，表明阿尼芬净具有显著体内抗肿瘤活性，且与一般化药相比对小鼠体重影响较小。ELISA实验结果表明阿尼芬净给药组与阳性对照组的血清IFN-γ和IL-4浓度均显著高于模型组与化药组(P＜0.05)。同时，肿瘤组织切片经免疫组化染色结果显示阿尼芬净中、高剂量组和阳性对照组的IFN-γ和GZMB表达显著高于模型组和化药组(P＜0.05)，表明阿尼芬净具有体内免疫激活的作用。
综上所述，本研究通过基于药效团模型和分子对接技术的虚拟筛选、化合物-靶点相互作用验证、体内外抗肿瘤活性和免疫激活作用的考察，成功筛选得到了具有PD-L1抑制功能的免疫抗肿瘤小分子化合物阿尼芬净，丰富了PD-1/PD-L1小分子抑制剂研究，为肿瘤免疫治疗提供了新的选择，也为其他免疫检查点小分子抑制剂和其他靶向小分子药物的开发提供了方法借鉴。