肿瘤免疫治疗已成为继手术治疗、化疗、放疗后的第四种治疗方法,其中肿瘤疫苗是肿瘤免疫治疗的重要手段。我们前期研究证明:肿瘤细胞的泛素化蛋白是肿瘤抗原的重要组成部分,基于泛素化蛋白的肿瘤疫苗能诱导肿瘤特异性免疫应答,并具有较好的抗肿瘤效果,因此,肿瘤细胞泛素化蛋白的获取是研制泛素化蛋白肿瘤疫苗的关键。目的前期我们将Vx3蛋白（含三个泛素分子结合位点的重组蛋白）结合至镍柱,成功获取了肿瘤细胞来源的泛素化蛋白,但该方法步骤繁琐、产效低下,有待进一步优化。本研究中,我们拟将Vx3蛋白偶联至纳米铝,以实现:（1）通过离心方法、快速简便地募集肿瘤细胞裂解液中的泛素化蛋白,以达到简化实验步骤、提高募集产效的目的;（2）泛素化蛋白与纳米铝即“抗原与佐剂”合二为一（α-Al₂O₃-Vx3-UPs）,以增强基于泛素化蛋白肿瘤疫苗的抗瘤效果。方法1.对羟基苯甲酸修饰法制备α-Al₂O₃-COOH-Vx3及其募集UPs诱导抗肿瘤免疫应答的研究1)α-Al₂O₃-COOH-Vx3的制备与鉴定:纳米铝与适量的对羟基苯甲酸90°C搅拌反应后,用正丁醇进行封闭,其后同EDC/NHS室温搅拌反应,反应所得产物用傅里叶红外光谱仪检测;修饰后的纳米铝同适量Vx3蛋白4°C搅拌反应过夜,荧光显微镜观察反应后纳米铝表面的荧光分布;通过等量纳米铝与不同量Vx3反应计算纳米铝偶联Vx3的能力;将α-Al₂O₃-COOH-Vx3放置不同时间,荧光显微镜观察其稳定性;2)α-Al₂O₃-COOH-Vx3募集肿瘤细胞泛素化蛋白（α-Al₂O₃-COOH-Vx3-UPs）及鉴定:将α-Al₂O₃-COOH-Vx3加入4T1肿瘤细胞裂解液4°C搅拌反应过夜,western blot检测其募集的泛素化蛋白;等量α-Al₂O₃-COOH-Vx3同不同量的4T1肿瘤细胞裂解液反应,计算其募集泛素化蛋白的能力;将α-Al₂O₃-COOH-Vx3-UPs放置不同时间,western blot检测其稳定性;透射电镜观察纳米铝偶联蛋白前后表面的变化;3)α-Al₂O₃-COOH-Vx3-UPs诱导免疫应答及其抗肿瘤效果的观察:α-Al₂O₃-COOH-Vx3-UPs免疫BABL/c小鼠,取脾细胞同灭活的4T1肿瘤细胞共培养,ELISA检测培养上清中IFN-γ的量;荷瘤小鼠用α-Al₂O₃-COOH-Vx3-UPs免疫治疗,测量肿瘤大小绘制肿瘤生长曲线及生存曲线。2.三乙氧基硅烷修饰法制备α-Al₂O₃-NH2-Vx3及其募集UPs诱导抗肿瘤免疫应答的研究1)α-Al₂O₃-NH2-Vx3的制备与鉴定:α-Al₂O₃纳米颗粒与适量的三乙氧基硅烷室温搅拌反应后,同戊二醛室温搅拌反应,两步反应所得产物用傅里叶红外光谱仪检测;修饰后的α-Al₂O₃纳米颗粒同适量Vx3蛋白4°C搅拌反应过夜,荧光显微镜观察反应后纳米铝表面的荧光分布;通过等量α-Al₂O₃纳米颗粒与不同量Vx3反应计算纳米铝偶联Vx3的能力;将α-Al₂O₃-NH2-Vx3放置不同时间,荧光显微镜观察确定其稳定性;2)α-Al₂O₃-NH2-Vx3募集肿瘤细胞泛素化蛋白（α-Al₂O₃-NH2-Vx3-UPs）及鉴定:将α-Al₂O₃-NH2-Vx3加入4T1肿瘤细胞裂解液中4°C搅拌反应过夜,western blot检测其募集泛素化蛋白的能力;等量α-Al₂O₃-NH2-Vx3同不同量的4T1肿瘤细胞裂解液反应,计算其募集泛素化蛋白的能力;将α-Al₂O₃-NH2-Vx3-UPs放置不同时间,western blot检测上清及沉淀中泛素化蛋白的量以确定其稳定性;透射电镜观察α-Al₂O₃纳米颗粒偶联蛋白前后表面的变化;3)α-Al₂O₃-NH2-Vx3-UPs诱导免疫应答及其抗肿瘤效果的观察:α-Al₂O₃-NH2-Vx3-UPs及α-Al₂O₃/Vx3-UPs、α-Al₂O₃-NH2-Vx3、α-Al₂O₃/cell lysate免疫BABL/c小鼠,取脾细胞同灭活的4T1肿瘤细胞共培养,ELISA检测培养上清中IFN-γ的量;荷瘤小鼠用α-Al₂O₃-NH2-Vx3-UPs及α-Al₂O₃/Vx3-UPs、α-Al₂O₃-NH2-Vx3、α-Al₂O₃/cell lysate、表阿霉素进行治疗,测量肿瘤大小绘制肿瘤生长曲线及生存曲线。3.α-Al₂O₃-Vx3-UPs诱导抗肿瘤免疫应答机制的初步研究1)DC2.4细胞吞噬α-Al₂O₃-Vx3-UPs及细胞内定位的观察:DC2.4细胞同α-Al₂O₃-Vx3-UPs共孵育不同时间流式细胞仪检测GFP+细胞比例;细胞经固定破膜后,染LC3,激光共聚焦显微镜观察GFP与LC3的共定位;2)BMDC递呈α-Al₂O₃-Vx3-UPs（OVA+）抗原的观察:取小鼠骨髓加细胞因子诱导BMDC;BMDC同α-Al₂O₃-Vx3-UPs（OVA+）共孵育6小时后,抗H2Kb-SIINFEKL抗体染色,并用流式细胞仪检测;3)BMDC负载α-Al₂O₃-Vx3-UPs（OVA+）后诱导T细胞增殖的观察:DC细胞3-MA处理12小时后,与α-Al₂O₃-Vx3-UPs（OVA+）共孵育6小时,加入CFSE染色的OT-1小鼠脾细胞培养3天后,流式细胞仪检测CD8+T细胞增殖。结果1.对羟基苯甲酸修饰法制备α-Al₂O₃-COOH-Vx3及其募集UPs诱导抗肿瘤免疫应答的研究1)α-Al₂O₃-COOH-Vx3的制备与鉴定:经过二步修饰后,α-Al₂O₃表面的大部分羟基已被“对羟基苯甲酸”修饰、并通过其COOH成功偶联Vx3蛋白;同时,部分未COOH化修饰的羟基可被正丁醇有效封闭,使之不能吸附任何蛋白。制备的α-Al₂O₃-COOH-Vx3在荧光显微镜下呈现绿色荧光,并在4°C条件至少稳定保存2周;检测显示:1mgα-Al₂O₃可结合50μg Vx3蛋白;2)α-Al₂O₃-COOH-Vx3募集肿瘤细胞泛素化蛋白（α-Al₂O₃-COOH-Vx3-UPs）及鉴定:α-Al₂O₃-COOH-Vx3能够从肿瘤细胞裂解液中募集泛素化蛋白,并保持结合状态至少2周以上（4°C保存条件）,α-Al₂O₃纳米颗粒偶联蛋白后表面呈现非晶层的薄膜;检测显示:1mgα-Al₂O₃-COOH-Vx3可有效募集150μg泛素化蛋白;3)α-Al₂O₃-COOH-Vx3-UPs诱导免疫应答及其抗肿瘤效果的观察:α-Al₂O₃-COOH-Vx3-UPs免疫小鼠脾脏细胞经灭活4T1肿瘤细胞刺激后产生高水平IFN-γ;α-Al₂O₃-COOH-Vx3-UPs免疫治疗能显著抑制荷瘤小鼠4T1肿瘤细胞的体内生长,延长小鼠生存期。2.三乙氧基硅烷修饰法制备α-Al₂O₃-NH2-Vx3及其募集UPs诱导抗肿瘤免疫应答的研究1)α-Al₂O₃-NH2-Vx3的制备与鉴定:傅里叶红外光谱仪检测结果显示单独的α-Al₂O₃纳米颗粒只在3400cm-1出现羟基峰,经三乙氧基硅烷修饰后2928cm-1处呈现明显的γ（CH2）峰,进一步同戊二醛反应后呈现出1720cm-1处的γ（C=O）基团峰和2860-2960cm-1处的ν（CH2）基团峰;α-Al₂O₃-NH2-Vx3在荧光显微镜下呈现绿色荧光,1mgα-Al₂O₃可结合75μg Vx3蛋白,该方法得到的α-Al₂O₃-NH2-Vx3可在4°C至少稳定保存3周;2)α-Al₂O₃-NH2-Vx3募集肿瘤细胞泛素化蛋白（α-Al₂O₃-NH2-Vx3-UPs）及鉴定:α-Al₂O₃-NH2-Vx3能够从肿瘤细胞中募集泛素化蛋白;α-Al₂O₃纳米颗粒偶联蛋白后表面呈现非晶层的薄膜;1 mgα-Al₂O₃可结合160μg泛素化蛋白,α-Al₂O₃-NH2-Vx3-UPs至少保持结合状态3周（4°C保存条件）。3)α-Al₂O₃-NH2-Vx3-UPs诱导免疫应答及其抗肿瘤效果的观察:免疫小鼠脾脏细胞经4T1肿瘤细胞刺激后分泌IFN-γ的量分别为:α-Al₂O₃-NH2-Vx3-Ups组:1240 pg/ml、α-Al₂O₃/Vx3-UPs组:768 pg/ml、α-Al₂O₃-NH2-Vx3组:129 pg/ml和α-Al₂O₃/细胞裂解液组:464 pg/ml;同α-Al₂O₃/Vx3-UPs、α-Al₂O₃-NH2-Vx3、α-Al₂O₃/细胞裂解液组相比,α-Al₂O₃-NH2-Vx3-UPs免疫组荷瘤小鼠的肿瘤显著减小,生存期延长。3.α-Al₂O₃-Vx3-UPs诱导抗肿瘤免疫应答机制的初步研究1)DC2.4细胞吞噬α-Al₂O₃-Vx3-UPs及细胞内定位的观察:DC2.4细胞负载α-Al₂O₃-Vx3-UPs同α-Al₂O₃/Vx3-UPs相比GFP+细胞比例显著增加;DC细胞负载α-Al₂O₃-Vx3-UPs后可观察到GFP与LC3共定位;2)BMDC递呈α-Al₂O₃-Vx3-UPs（OVA+）抗原的观察:诱导的BMDC细胞表面CD11c表达量达80%以上;BMDC细胞同α-Al₂O₃-Vx3-UPs（OVA+）共孵育6小时后,细胞表面H2Kb-SIINFEKL的表达同负载α-Al₂O₃/Vx3-UPs（OVA+）相比显著增加;3)BMDC负载α-Al₂O₃-Vx3-UPs（OVA+）后诱导T细胞增殖的观察:BMDC细胞负载α-Al₂O₃-Vx3-UPs（OVA+）能显著刺激OT-1小鼠CD8+T细胞增殖,其增值可被3-MA抑制。结论1.对羟基苯甲酸修饰法能够将Vx3蛋白偶联至α-Al₂O₃,所得产物α-Al₂O₃-COOH-Vx3能有效募集肿瘤细胞的UPs,α-Al₂O₃-COOH-Vx3-UPs能够诱导肿瘤特异性免疫应答,并具有一定的抗肿瘤效果;2.三乙氧基硅烷修饰法可将Vx3蛋白偶联至α-Al₂O₃,所得产物α-Al₂O₃-NH2-Vx3能从肿瘤细胞裂解液中募集UPs用于肿瘤免疫治疗;α-Al₂O₃-NH2-Vx3相较于α-Al₂O₃-COOH-Vx3,能够募集更多的UPs,α-Al₂O₃-NH2-Vx3-UPs稳定性更好;并且α-Al₂O₃-NH2-Vx3-UPs对肿瘤的免疫治疗效果优于α-Al₂O₃/Vx3-UPs和α-Al₂O₃/细胞裂解液。3.相对于α-Al₂O₃吸附的UPs,DC能高效吞噬与α-Al₂O₃偶联的UPs,通过自噬途径交叉递呈抗原并诱导特异性CD8+T细胞应答。