恶性肿瘤长久以来都是国际上医学研究的焦点，这种多因素导致的复杂疾病已经严重威胁人类健康和生活。目前研究认为，肿瘤的发生主要是由于癌基因的过度活化和（或）抑癌基因的功能缺失引起的。在这些过度活化的癌基因中，有很多作为肿瘤发生和演变的主要驱动因素，活跃于肿瘤发展的各个阶段。其中受体型酪氨酸激酶（Receptor Tyrosine Kinase, RTK）就属于推动细胞发生恶性转化和肿瘤进程的重要因素。这类具有激酶活性的细胞膜表面受体也位于正常细胞，当与特异配体结合后，活化的激酶结构域和磷酸化酪氨酸会向下游传递活化信号，激活一系列生长、发育和生存相关的通路。然而，在肿瘤细胞或者恶性转化细胞中，这类分子往往呈过度表达和（或）持续活化状态，对肿瘤各种生物行为学表现起到至关重要的作用。因此，在特定的肿瘤细胞中，选取其赖以生存或者高度表达的RTK作为治疗靶点，抑制其丰度和活性，对于此类肿瘤能够起到关键的抑制作用。胰岛素样生长因子受体（Insulin-like Growth Factor-1Receptor, IGF-1R）和胰岛素受体（Insulin Receptor, IR）已被证实在多种肿瘤中存在高表达，参与细胞的恶性转化以及肿瘤细胞的发生发展，其产生的促进生长和能量代谢效应是肿瘤细胞生长和生存所必需。因此，目前许多药物研发公司和实验室将目光汇聚在这两个RTK上。IGF-1R和IR同属一个亚家族，具有60%的同源性，在细胞膜表面能够形成同源二聚体，也能相互结合形成异源二聚体。特异配体与受体胞外段结合后，可激活受体激酶活性，胞内段特定的酪氨酸残基发生磷酸化，随后募集并结合下游接头分子胰岛素受体底物（Insulin Receptor Substrate, IRS），进而激活PI3K和Ras，开启AKT和MAPK信号通路的转导，介导细胞的生长和分化、葡萄糖的摄取和代谢等效应。根据大量研究和文献报道，现已证实IGF-1R和IR与多种肿瘤的发生发展密切相关。目前，针对IGF-1R的靶向药物包括抗体和小分子抑制剂也已经开发并进入临床试验阶段，遗憾的是，临床III期的试验结果令人沮丧，主要体现在IR对IGF-1R的代偿，导致靶向干预效果不佳。此外，IGF-1R和IR与其它家族RTK成员组成的杂合受体，对于抗肿瘤药引发的继发耐药也发挥重要作用，如IGF-1R和EGFR，IR与Met均可形成异源二聚体。因此，在克服这些问题的同时，开发新的治疗策略，对于此类肿瘤的治疗具有重要的临床意义。泛素介导的蛋白质降解是细胞内蛋白质最主要的负向调节方式。该过程是在泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3的协同作用下进行的。结合泛素分子的底物蛋白随后在蛋白酶体或溶酶体中降解。依靠泛素连接酶E3对底物蛋白特异的识别能力，决定了泛素介导的蛋白降解具有特异性。在本研究中，我们以IGF-1R和IR为靶点，选取了分子伴侣相关泛素连接酶CHIP（Carboxy terminus of Hsc70Interacting Protein）的U-box结构域作为功能结构域，行使泛素化、降解功能；将IGF-1R和IR的胞内接头分子IRS-1（Insulin Receptor Substrate-1）的磷酸化酪氨酸结合（phosphotyrosine binding，PTB）结构域作为结合结构域，发挥识别并结合特异底物蛋白的功能。利用分子克隆技术，将二者在基因水平融合，构建为重组泛素连接酶，旨在特异降解IGF-1R和IR，从而实现抑制肿瘤。【目的】1.明确重组泛素连接酶对特异底物蛋白IGF-1R和IR的降解功能；2.揭示重组泛素连接酶特异降解IGF-1R和IR的作用机制；3.监测重组泛素连接酶介导的靶蛋白降解而引起的肿瘤细胞生物学行为的改变；4.初步评估重组泛素连接酶在动物水平抑制实体肿瘤生长的作用。【方法和结果】1.重组泛素连接酶PTB-U-box对IGF-1R和IR的特异降解我们首先采用分子克隆技术，构建了重组泛素连接酶PTB-U-box，及其相应的功能结构域U-box缺失突变体PTB、功能结构域U-box突变体PTB-U-box（H260Q），将其分别导入IGF-1R和IR高表达的人肝癌细胞系HepG2、人宫颈癌细胞系HeLa以及人胰腺癌细胞系PANC-1，发现重组泛素连接酶PTB-U-box能够有效下调IGF-1R和IR的蛋白水平,而无关受体EGFR、Met的蛋白水平不受影响。另外，通过实时定量PCR，证实重组泛素连接酶对靶蛋白的转录不产生影响，表明其作用于IGF-1R和IR转录后水平。2.重组泛素连接酶特异降解IGF-1R和IR的作用机制我们通过IGF-1、胰岛素或血清处理HepG2细胞，采用免疫沉淀检测了不同处理条件下IGF-1R和IR的胞内域磷酸化水平，证实了特异配体和血清处理均能使受体胞内域活化。随后选取转染效率较高的HeLa细胞系为工具细胞，通过免疫共沉淀实验，明确了仅含有磷酸化酪氨酸结合结构域的PTB以及重组泛素连接酶PTB-U-box均能够与活化的受体结合；采用体内泛素化实验，验证了重组泛素连接酶PTB-U-box能够促进活化受体发生泛素化，进而使其降解的作用机制。而不含U-box的PTB和U-box突变的PTB-U-box（H260Q）则不能有效促发靶受体泛素化。3.重组泛素连接酶介导的靶蛋白降解而引起的肿瘤细胞生物学行为的改变IGF-1R和IR介导的信号通路在胞内引起一系列生物学效应，主要与细胞的生长、生存和能量代谢密切相关。我们选取HepG2细胞，通过免疫印迹实验，明确了PTB-U-box导致IGF-1R和IR下游信号分子AKT和ERK的磷酸化水平降低，提示PTB-U-box能够抑制IGF-1R和IR介导的信号通路；随后在HeLa细胞和HepG2细胞中，通过MTT、Transwell等实验检测了肿瘤细胞的增殖、侵袭、凋亡的改变；在MCF-10A细胞细胞中，检测了PTB-U-box过表达后E-cadherin、N-cadherin、Twist等EMT标志分子和关键转录因子水平的改变，初步探索了PTB-U-box对EMT过程的影响。这些实验结果表明：重组泛素连接酶PTB-U-box通过泛素化、降解活化的IGF-1R和IR，降低它们的细胞膜表面含量，弱化其所介导的信号通路，从而发挥抑制肿瘤细胞恶性表型的作用。4.重组泛素连接酶在动物水平对实体肿瘤生长的抑制作用鉴于以上实验结果证实重组泛素连接酶PTB-U-box具有明确的体外抗肿瘤效应，我们构建并包装了携带PTB-U-box和不含U-box的PTB的腺病毒载体，即Ad-PTB-U-box和Ad-PTB。在验证了该重组腺病毒的表达及其对靶受体的降解功能后，我们采用肿瘤原位注射的方法，在HepG2荷瘤裸鼠体内评估了重组泛素连接酶对实体肿瘤生长的抑制情况，结果表明Ad-PTB-U-box能够有效抑制裸鼠移植实体肿瘤的生长。通过这部分实验，我们证实重组泛素连接酶PTB-U-box通过引发IGF-1R和IR蛋白泛素化降解，可有效抑制IGF-1R和IR高表达的肿瘤的在体生长。5.重组泛素连接酶对肿瘤细胞葡萄糖代谢的影响胰岛素（insulin）介导的葡萄糖代谢是细胞内最主要的能量来源，细胞分解葡萄糖产生能量以满足生长分化所需。在肿瘤细胞中，活跃的生长和增殖促使细胞发生代谢重编程，其中葡萄糖摄取高度活跃和有氧酵解是肿瘤细胞糖代谢的鲜明特征。在本部分实验中，我们主要探索了重组泛素连接酶能否影响肿瘤细胞糖代谢。我们选取HepG2细胞，证实了重组泛素连接酶能够抑制胰岛素介导的葡萄糖转运蛋白4（glucose transporter4）的细胞膜转位，进而降低肿瘤细胞对葡萄糖的摄取，最终抑制糖酵解途径产物乳酸和丙酮酸的生成。【结论】靶向IGF-1R和IR的重组泛素连接酶PTB-U-box，通过引发IGF-1R/IR泛素化、降解，导致其下游信号转导削弱，可以有效地抑制IGF-1R/IR过表达的肿瘤细胞增殖、侵袭、凋亡抵抗、糖有氧酵解等多种恶性表型，从而抑制荷瘤鼠在体肿瘤生长。该项基于接头分子IRS-1构建重组泛素连接酶的应用型研究在国际上尚属首次，具有一定的开创性。本课题研究，确认了基于靶向性泛素化的重组PTB-U-box肿瘤治疗策略的可行性。且通过分子、细胞和动物水平的机制研究和功能验证，我们得以系统地、多层次地评价重组泛素连接酶PTB-U-box对肿瘤细胞生物学行为的影响作用，拓展了重组泛素连接酶的功能范围，证实了重组泛素连接酶具有特异性和多靶点的优势。通过本课题研究，将泛素介导的蛋白质降解从理论知识上升到实际应用，并提供了成功的范例，因而可为肿瘤的靶向治疗提供新的思路。此外，该研究成果已申请国家发明专利一项，并已获得授权。