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该研究针对大熊猫为主的濒危动物繁殖率低的两大主要问题,以大熊猫、小熊猫和东北虎为研究对象,开展了在动物生长发育和生殖过程中发挥重要作用的促性腺激素(FSH/LH)、生长激素及其受体(GH/GHR)的基因克隆、序列分析和表达研究,并探讨了今后生物工程生产大熊猫等濒危动物FSH/LH和GH用于人工繁殖实践的意义和可能性.主要结果如下:1.利用RT-PCR技术从垂体组织扩增出大熊猫促性腺激素α、FSHβ和LHβ亚基编码区序列,它们分别编码120、129和141氨基酸的前体蛋白质,预测的分子量分别为13.6kD,14.6kD和15kD.2.将构建的真核表达载体pcDNA/α分别与pcDNA/FSHβ和pcDNA/LHβ共转染COS7细胞,进行瞬时表达.RT-PCR检测,表明三个亚基因在COS7细胞中得到正常转录.3.构建大熊猫α,FSHβ和LHβ亚基基因的原核表达载体pGEX-α,pGEX-FSHβ和pGEX-LHβ,IPTG诱导后在BL21宿主菌中得到高效融合表达,表达的融合蛋白GST-α,GST-FSHβ和GST-LHβ的分子量分别为36kD、38kD和41kD,并以不溶的包涵体形式存在于细胞中.无法直接用谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析柱纯化.4.克隆并测序小熊猫α和LHβ亚基的编码区序列,相似于大熊猫序列,它们也编码120和141个氨基酸的前体蛋白,预测的分子量分别为13.5kD和15.1kD,两种动物LH序列的同源性达到95﹪以上.5.与多数哺乳类动物相似,克隆的东北虎α、FSHβ亚基的开放阅读框为363bp和393bp,编码120和129个氨基酸的蛋白,分子量为13.5kD和14.7kD.但LHβ亚基序列具明显特异性,编码142个氨基酸的前体蛋白,在信号肽部分比其它物种多一个Leu,其预测分子量为15.1kD.在核苷酸和氨基酸水平,东北虎三个亚基序列与其它物种相应序列也具有较高的同源性(64.7-96.6﹪).6.FSH和LH在畜牧业生产中被广泛用于促发情和排卵,目前已在大熊猫、东北虎等濒危动物人工繁殖中得到试用,但是效果普遍较差,其原因不甚清楚,可能与所用异源激素的异质性有关,使用高同源性激素可能会产生更好的效果.7.克隆和分析了进化上较保守,并在生长发育、生殖和免疫调节中发挥重要作用的大熊猫GH(AmGH)和GHR(AmGHR)基因.8.以pGEX-4T-1为表达载体,在大肠杆菌BL21中通过与GST融合的方式高效表达了大熊猫GH.可溶性分析表明表达的融合蛋白(GST-AmGH)以不溶的包涵体形式存在,采用0.1M NaOH溶解包涵体,得到的蛋白与谷胱甘肽琼脂糖树脂具有较高亲和力,能通过亲和层析方便地纯化出的GST-AmGH,为将来用凝血酶切割得到有生物活性的大熊猫重组GH用于提高幼仔免疫力的研究奠定基础.