论文部分内容阅读
由β-葡糖苷酸酶(beta-glucuronidase,GUSB)缺陷导致β-D-葡糖醛酸贮积的斯赖综合征(Sly syndrome)是一种典型的代谢异常单基因遗传性疾病。现有的替代疗法、药物防治以及手术矫正主要是改善患者的病情,减少痛苦,即所谓“表现型治疗”。基因治疗的出现为这类单基因遗传性疾病的治疗开辟了新的途径。单基因遗传性疾病的基因治疗就是将具有正常功能的治疗基因通过相应的载体导入单基因缺陷的靶组织细胞中,从而达到疾病治疗目的。虽然基因治疗的出现为单基因遗传性疾病患者带来了治愈的曙光,但目前传统的基因治疗手段仍然存在缺陷:(1)对于采用将有功能的基因整合到基因组的基因治疗方案,存在导入的外源功能性基因难以持续表达及外源基因的整合可能对整合位点上下游基因的表达产生影响的缺陷;(2)对于采用对缺陷基因进行原位修复的基因治疗方案,存在同源重组效率较低的缺陷。研究人员在2014年建立了一种新的无启动子基因组定点整合基因治疗方案,即在不使用基因组编辑工具酶的情况下,将外源治疗基因整合在细胞内源性高表达基因的终止密码子之前,同时在外源治疗基因的5’端加入可自剪切的T2A小肽序列,这样外源基因即可伴随着内源基因一同转录翻译成一个融合蛋白,因此可以受到内源性启动子的严格调控。表达的融合蛋白在具有自剪切功能的T2A小肽的作用下产生目的蛋白,达到一定治疗效果。尽管该方法部分解决了上述两个基因治疗方案的缺陷,但外源基因在细胞内的同源重组效率依然比较低,而且其治疗策略的使用范围可能会受到一定的限制。有鉴于此,本课题在该新基因治疗方案的基础上,使用CRISPR/Cas9系统,造成肝细胞基因组中特定区域DNA双链断裂,进而通过激活细胞内同源重组系统达到提高基因同源重组的效率的目的,最终可以将外源治疗基因定点整合在小鼠肝细胞内白蛋白(Albumin,Alb)基因终止密码子之前。本课题将使用小鼠肝癌Hepal-6细胞与GUS缺陷小鼠的MEF细胞对该新方案的治疗效果进行评估,以期建立一种更高效更安全的针对单基因缺陷的遗传性疾病的基因治疗方案。本课题主要分三个部分。1.针对小鼠Albumin(mouse Albumin,mAlb)基因终止密码子之后基因组DNA靶位点的sgRNA的设计及筛选:将针对人密码子优化的hCas9基因片段克隆至真核表达载体中,得到用于真核表达的hCas9表达载体pCMV-hCas9。根据NCBI数据库以及文献报道,针对mAlb基因终止密码子后的甚因组DNA设计4个sgRNA并构建相应的sgRNA表达载体。将4个sgRNA表达载体分别与pCMV-hCas9表达载体共转染至Hepa1-6细胞系中,72小时后提取基因组,使用PCR特异性扩增打靶位点区域DNA片段,最后通过T7E1酶切分析筛选得到针对小鼠白蛋白基因终止密码子之后基因组DNA靶位点的具有较高生物学活性的sgRNAs。2.构建用于mAlb基因组定点整合并携带报告基因的打靶载体:首先根据mAlb基因组序列信息以及sgRNA打靶位点,设计用于同源重组的上下游同源臂,然后在使用PCR的方式分别扩增出用于mAlb基因组定点整合的上下游同源臂和Luciferase报告基因片段的基础上,将上下游同源臂与Luciferase报告基因依次连入打靶骨架载体中。依据打靶载体是否携带sgRNA表达框,分别构建表达sgRNA与不能表达sgRNA的两个打靶载体。在可表达sgRNA的打靶载体一端引入sgRNA结合位点,由此构建在进入细胞后可被Cas9-sgRNA切割线性化的打靶载体。最终得到三个打靶载体,分别为可表达sgRNA的打靶载体、不表达sgRNA的打靶载体与可表达sgRNA并可被线性化的打靶载体。最后利用荧光素酶检测系统,使用不表达Alb基因的G422(小鼠脑胶质瘤)细胞系作为阴性对照细胞系,在Hepa1-6细胞系中检测不同打靶载体的同源重组效率。3.构建用于mAlb基因组定点整合并携带hGUSB治疗基因的打靶载体及体外实验研究:首先,通过克隆获得在5’端连有T2A小肽序列的hGUSB治疗基因,将其连入含有mAlb上下游同源臂的打靶骨架载体中,在此基础上,采用与第二部分类似的策略分别构建可表达sgRNA的打靶载体、不表达sgRNA的打靶载体与可表达sgRNA并可被线性化的打靶载体。将这三个打靶载体分别与hCas9表达载体共同转染Hepa1-6细胞或GUS缺陷小鼠的MEF 细胞系,在细胞水平分别通过 Real-Time Quantitative PCR、Western-Blot和GUS染色检测治疗基因的表达水平,从而评估该系统的潜在应用价值。本课题获得了以下实验结果:1.筛选获得了针对mAlb基因终止密码子之后基因组DNA靶位点的高切割活性的sgRNA;2.通过PCR克隆得到了用于mAlb基因组定点整合并携带luciferase报告基因的3种打靶载体,并在体外细胞系中测试不同的打靶载体的同源重组效率。结果表明,在具有高Alb基因启动子活性的Hepa1-6细胞系中使用CRISPR/Cas9技术,相较于不使用CRISPR/Cas9的对照组可大幅度(约10倍)的提高同源重组效率,实现报告基因的特异性高表达。当在打靶载体中加入可使之线性化的sgRNA切割位点时,还可以更有效(约20倍)的诱发基因同源重组;而不论是否使用CRISPR/Cas9技术,在Alb基因启动子低活性的G422细胞系中,均检测不到外源基因的大量表达;3.通过PCR克隆获得了连有T2A小肽序列的hGUSB基因片段,在此基础上,构建了三种携带治疗基因的打靶载体,通过对GUSB基因在Hepa1-6细胞与GUS缺陷小鼠的MEF细胞系中mRNA与蛋白表达的检测,证明了该基因治疗方案可实现外源治疗基因在靶细胞中的表达。综上所述,本课题选择在小鼠肝脏组织中特异性高表达的白蛋白(Albumin,Alb)基因为靶基因,利用CRISPR/Cas9技术,通过基因定点打靶的方式,在白蛋白终止密码子之前定点插入在5’端携带自剪接肽T2A的人GUSB基因,由此可以实现在不影响白蛋白的自然表达及分泌的状况下,肝组织细胞可以高效表达正常有活性的人β-葡糖苷酸酶。本课题所建立的基于CRISPR-Cas9技术的无启动子基因组定点整合系统,将为单基因遗传性疾病的治疗开辟新的途径。