目的心肌L-型钙通道（Cav1.2）参与心肌兴奋-收缩耦联和其他重要的电化学活动。钙调蛋白（calmodulin,CaM）结合于L-型钙通道α亚基C-末端的不同位点可以引发钙依赖性激活（calcium dependent facilitation,CDF）和钙依赖性失活（calciumdependent inactivation,CDI）。电压门控性L-型钙通道特有的现象“衰减”,即在膜片钳全细胞或内面向外的单通道记录式中,当胞浆侧用人工细胞内液灌流时,L-型钙电流就会急剧的下降或消失,这种现象被称为“衰减”,它的机制主要是细胞因子的丢失。本实验在豚鼠心室肌细胞上,应用内面向外的膜片钳单通道记录式研究突变的CaM对“衰减”后钙通道活性的影响,来探讨CaM上不同的钙离子结合位点与L-型钙通道活性的相互关系,即CaM的N-叶和C-叶上的钙离子结合位点究竟谁与CDF相关,谁与CDI相关。从分子水平上揭示钙调蛋白对L-型钙通道的调节机制。材料与方法一、突变蛋白CaM12、CaM34的提取CAM12,即钙调蛋白四个钙离子结合位点中,位于氨基叶（N-lobe）上的1、2位点分别点突变,使其失去钙离子的结合能力。CAM34,即钙调蛋白四个钙离子结合位点中,位于羧基叶（C-lobe）上的3、4位点分别点突变,使其失去钙离子的结合能力。CAM12的提取过程是,编码位点2已突变的钙调蛋白的目的基因存在于质粒载体pGEX-6P-3当中,用质粒DNA提取试剂盒（QIAGEN Plasmid PurificationHandbook）提取pGEX-6P-3质粒DNA。再用限制性核酸内切酶（Apa-Ⅰ）将质粒DNA切成两段,加入设计好的含位点1特异性点突变基因的引物（primer-1F和primer-1R）跑PCR。用DpnⅠ消化甲基化的和没有变异的模板,将其转化入受体细胞BL21（DE3）中,于LB培养基37摄氏度孵育过夜。培养克隆株并检测基因序列。类似的方法提取CaM34。二、单个心室肌细胞的制备健康成年豚鼠,体重300～600克,雌雄不限,用苯巴比妥钠（6.6mg/100g）腹腔注射麻醉。气管插管行辅助呼吸,在体条件下主动脉插管,取出心脏,用Langendorff灌流装置进行灌流及消化【胶原酶（208051）2%及胶原酶（208052）3%,温度39℃】。再用蛋白酶和DNA酶37℃孵育以使细胞表面光滑。之后离心两次置于4℃冰箱中冷藏备用。三、膜片钳内面向外式单通道电流记录和数据分析应用AXOPATCH 200B膜片钳放大器,在内面向外的膜片记录式下,对豚鼠心室肌细胞的L-型钙通道的单通道电流进行记录。通过钙通道的钡离子流由—70至0mV的去极化脉冲引出,波宽200ms,刺激频率0.5Hz,输出常数α×100,经由膜片钳放大器记录后以3.3kHz的采集速率输入计算机,减去漏电流。单通道电流在细胞贴附式下记录两分钟,之后抬起玻璃微电极使其形成内面向外的膜片记录式,维持一分钟,立即加药（CaM+ATP）,等待至少20分钟以观察电流的恢复情况。应用公式Ⅰ=N×Po×i,其中I是测定实验脉冲开始后5～105ms期间的平均电流,i是单通道电流幅值,N为膜片中的通道数目,Po为通道的平均时间开放频率,NPo代表通道开放频率,计算出NPo的大小,再以在无钙灌流液中稳定记录3分钟的平均NPo值作为细胞的基础NPo,以其作为参照,计算出通道的相对NPo值来进行分析。本实验的效应指标是通道活性恢复百分比（Channel Activity）,指的是通道活性恢复峰值期的平均NPo与细胞贴附记录式下的平均NPo的比值。实验结果用均值±标准误表示,数据用Student’s t检验统计分析,p＜0.05为显著差异。结果一、分子生物学实验结果应用特异性点突变提取试剂盒（QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit）提取突变蛋白CAM12。检测钙调蛋白4个编码钙离子结合位点基因的碱基序列,其86位的胸腺嘧啶变成胞嘧啶,即所编码的氨基酸由谷氨酸变成丙氨酸,位点1突变成功。第194位的胸腺嘧啶变为胞嘧啶,其编码的氨基酸由谷氨酸变为丙氨酸,位点2突变。位点3、4的碱基序列同野生型钙调蛋白一致,没有发生突变。类似的方法提取突变蛋白CAM34,检测钙调蛋白4个编码钙离子结合位点基因的碱基序列,其295和296位的A、G分别变成T、T,即所编码的氨基酸由丝氨酸变成苯丙氨酸（S101F）,位点3突变成功。第413位的A变为C,其编码的氨基酸由谷氨酸变为丙氨酸（E140A）,位点4突变。位点1、2的碱基序列同野生型钙调蛋白一致,没有发生突变。电泳（SDS-PAGE）结果看其浓度和纯度,浓度和纯度都很高。应用Infinite-200（Tecan公司）测其精确浓度,i-Control软件分析得出蛋白580nm波长处的吸光度数据,与BSA标准液进行浓度对照,得出CaM12的精确浓度为0.73mg/ml,CaM34的精确浓度是1.59mg/ml。二、电生理学实验结果（一）CaM34对L-型钙通道活性的恢复作用呈现剂量依赖性和钙离子浓度依赖性:选取中间钙离子浓度（250nM）CaM34数据点中具有代表性的柱状电流图直观地反映CaM34恢复通道活性的浓度变化趋势。结果显示,在一定钙离浓度下,CaM34对通道活性恢复的百分比随浓度的增高先升高后降低,呈现“钟型”的曲线变化趋势。在不同钙离子浓度0、250、500nM时,观察不同浓度的CAM34（0.35、0.7、1.4、2.1、3.5μM）对“衰减”后钙通道活性的影响。结果显示,在一定钙离子浓度下,CaM34对“衰减”后钙电流的恢复效果同CaM34的浓度呈“钟型”相关。当升高钙离子浓度([Ca²⁺]＜1μM)时,通道活性恢复曲线的激活相无明显变化,而失活相随着钙离子浓度的增大而逐渐提前。选取0.7、1.4、2.1、3.5μM钙调蛋白各浓度点做柱状图比较器不同钙离子浓度间的差别,结果显示,当CaM34的浓度由低到高递增时,钙离子浓度越高越早出现具有统计学差异的减小。也就是说,较低浓度点的不同钙离子浓度的复活百分比比较无统计学差异,即钙离子对激活相无影响;较高浓度点,钙离子浓度越高越早出现具有统计学意义的复活百分比的减小,即钙离子浓度越高失活相就越提前。（二）CaM12对L-型钙通道作用的剂量依赖性和钙离子浓度依赖性:选取中间钙离子浓度（250nM）CaM12数据点中具有代表性的柱状电流图直观地反映CaM12恢复通道活性的浓度变化趋势。结果显示,在一定钙离浓度下,CaM12对通道活性恢复的百分比随浓度的增加而升高,呈现浓度依赖性的正相关曲线变化趋势。在不同钙离子浓度0、250nM时,观察不同浓度的CAM12（0.35、0.7、1.5、3.5、7μM）对“衰减”后钙通道活性的影响。结果显示,在一定钙离子浓度下,CaM12对“衰减”后钙电流的恢复效果同CAM12的浓度呈正相关。当升高钙离子浓度([Ca²⁺]＜1μM)时,通道活性恢复曲线的激活相左移,无明显的失活相。选取0.35、0.7、1.5、3.5、7μM钙调蛋白各浓度点做t-检验比较不同钙离子浓度间CaM12对通道作用的差别,结果显示,在相应的钙调蛋白浓度下,钙离子浓度为250nM时的通道活性恢复百分比高于钙离子浓度为0nM时的通道活性恢复百分比。也就是说,钙离子浓度越高激活相越提前出现,在0.35～7μM的CaM12浓度下无明显的失活效应。讨论在心肌细胞中,钙调蛋白作为一种关键性的钙离子感受器,直接或间接的调节兴奋—收缩耦联和其他重要的生理过程。CaM结合于Cav1.2α1亚基C-末端的区域可以调节心肌L-型钙通道的活性,在钙依赖性激活（CDF）和失活（CDI）及“衰减”现象中发挥重要的调控作用。但具体的调节机制还未阐明。目前为止,在α1亚基C-末端上已有三个比较明确的CaM结合位点被认为与L-型钙通道的CDI和CDF密切相关,IQ-motif、A-motif和CB-motif。研究表明,这三个区域都可与钙结合型CaM结合,apoCaM可以以低亲和力与IQ-motif结合。IQ-motif在L-型钙通道的CDI和CDF中都发挥作用;A-motif和CB-motif与通道活性的关系尚待进一步研究。钙调蛋白有四个钙离子结合位点,1、2位点位于N-lobe,3、4位点位于C-lobe,1、2位点与钙离子的亲和力较3、4位点低10倍左右,在L-型钙通道的活性调节上发挥着不同的作用。在P/Q-型钙通道的研究中,已提出了钙结合于CaM C-lobe上的3、4钙离子结合位点与钙依赖性激活作用相关,钙结合于CaM N-lobe上的1、2钙离子结合位点与钙依赖性失活作用相关。而对于CaM N-叶和C-叶上的钙离子结合位点与L-型钙通道CDI和CDF的相关性还存在争议。本实验应用突变蛋白CaM12、CAM34作用于豚鼠心室肌细胞L-型钙通道,记录“衰减”一分钟后单通道电流的恢复状况。结果显示,当钙离子浓度为0、250nM时,CAM12浓度分别为0.35、0.7、1.5、3.5、7μM（+3mM ATP）时,CAM12对单通道电流的恢复效果随浓度增加呈正相关,并随钙离子浓度的增加激活相左移,提示钙离子与钙调蛋白的3、4钙离子结合位点结合可以促进通道的激活。当钙离子浓度为0、250、500nM时,CAM34浓度分别为0.35、0.7、1.4、2.1、3.5μM（+3mMATP）时,CAM34对单通道电流的恢复效果随浓度增加呈“钟型”相关,并随钙离子浓度的增加失活相左移,提示钙离子与钙调蛋白的1、2钙离子结合位点结合可以促进通道的失活。结论CAM12、CAM34对心肌L-型钙通道活性的恢复作用呈现浓度和钙离子依赖性;钙离子可以增强CaM12对通道的激活作用,而对失活作用影响不明显,提示CaM C-叶与CDF相关。钙离子可以增强CaM34对通道的失活作用,而对激活作用影响不明显,提示CaM N-叶与CDI相关。