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目的:探讨应用组织块培养法体外分离、纯化、扩增兔滑膜间充质干细胞(synovial mesenchymal stem cells,SMSCs)的可行性及其分离细胞的多向诱导分化潜能;建立增强型绿色荧光蛋白(enhanced Green Fluorescent Protein,e GFP)基因/超顺磁性氧化铁纳米颗粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPIO)双标记兔滑膜间充质干细胞的技术,为解决SMSCs对关节内软骨损伤修复提供可靠的体内、外示踪方法。方法:无菌获取兔膝关节脂肪垫滑膜组织,通过组织块接种法分离原代SMSCs,联合有限稀释法体外纯化、扩增兔SMSCs;镜下观察SMSCs的细胞形态学及其生长特点;以最佳感染复数(Multiplicity Of Infection,MOI)的e GFP-慢病毒感染处于对数生长期的兔SMSCs,荧光显微镜下及流式细胞仪观察e GFP标记阳性率;e GFP标记SMSCs经嘌呤霉素充分筛选后行SPIO标记,透射电镜下及普鲁士蓝染色观察SPIO标记结果。采用Alcian Blue、碱性磷酸酶、油红―O‖染色检测双标记SMSCs分别在成软骨、成骨、成脂诱导液中的定向诱导分化情况。采用CCK8试剂检测e GFP/SPIO双标记后SMSCs的细胞增殖能力及其细胞活性。结果:1、兔脂肪垫表层滑膜组织经组织块接种法2~3天后,组织块周围即可开始长出原代滑膜细胞,10~12天便可获得大量滑膜细胞,经有限稀释法纯化扩增,SMSCs细胞形态更加均一。2、e GFP成功标记SMSCs后,荧光显微镜下可见细胞内出现绿色荧光,且荧光表达率随MOI值的增大而增高;当MOI值为100的慢病毒感染SMSCs时,细胞可获得(38.4±2.7)%的e GFP转染率,细胞仍保持良好的状态,经嘌呤霉素筛选后可达到95%以上的荧光表达率,标记30d之后,标记细胞荧光仍然稳定表达,当MOI>100时,细胞形态出现改变。3、以50μg/ml的SPIO标记经筛选后的e GFP细胞,经普鲁士蓝染色,镜下可见细胞标记率达(98.4±1.2)%,透射电镜下观察显示SMSCs的细胞质和吞饮小泡内可见大量高电子致密度颗粒,而对照组细胞质内和吞饮小泡内未见明显高电子致密度颗粒。4、双标记SMSCs经成软骨细胞定向诱导21天后,诱导细胞Alcian Blue染色结果显示:细胞外基质明显染成蓝色;双标记SMSCs经成骨细胞定向诱导21天后,诱导细胞碱性磷酸酶染色显示:细胞内碱性磷酸酶表达阳性;双标记SMSCs经成脂肪细胞定向诱导14天后,诱导细胞油红―O‖染色结果显示:细胞内出现明显的红色颗粒状脂滴。5、CCK-8检测发现:SMSCs细胞双标记后仍保持良好的增殖状态,未标记组与标记组细胞比较无显著差异(P>0.05),未产生明显细胞毒性。结论:1、组织块培养法能高效的获取原代SMSCs,并且操作简单,细胞污染几率小。2、分离、纯化后的SMSCs细胞具有良好的增殖能力,并具有明显的间充质干细胞的形态特性。3、e GFP/SPIO双标记SMSCs效率高,双标记后细胞仍具有多向诱导分化潜能,未产生明显细胞毒性,具有一定可行性,为SMSCs对关节内软骨损伤修复的示踪研究奠定了实验基础。