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胰腺癌是常见的消化系统恶性肿瘤,恶性程度高,早期诊断困难,预后极差,目前仍缺乏有效治疗手段。DNA甲基化是主要的表观遗传修饰之一,与肿瘤发生发展密切相关。鉴定肿瘤细胞异常DNA甲基化变化,并针对性地进行调节将有利于肿瘤的诊断和治疗。CDH1(Cadherin 1)基因位于人染色体16q22,编码E-钙粘蛋白,参与调节细胞粘附、迁移和上皮细胞增殖。CDH1基因的突变与胃癌、乳腺癌、结直肠癌、甲状腺癌和卵巢癌密切相关,研究表明,DNA甲基化在CDH1基因的表达调节中起作用,但在不同肿瘤中作用有差异。本研究检测了CDH1在不同胰腺癌细胞中的基因表达及启动子区DNA甲基化水平,通过转染载体CRISPR/dCas9-Dnmt3a和gRNA-CDH1,检测DNA甲基化影响CDH1基因表达及对细胞恶性表型的作用,并探讨了特异位点DNA甲基化修饰在肿瘤治疗中的潜在应用。1、胰腺癌中DNA甲基化对基因表达的影响根据已发表的论文筛选肿瘤相关基因EGFR、HOXB5、CDH1、DDR2和RUNX3。为研究基因启动子区DNA甲基化对基因表达的作用,利用实时定量PCR检测基因mRNA表达,重亚硫酸氢盐测序PCR(bisulfite-sequencing PCR,BSP)分析上述基因启动子区CpG位点的甲基化状态,并在两种胰腺癌细胞PANC-1和CFPAC-1与正常胰腺上皮细胞HPC-Y5中进行了比较。结果显示,EGFR基因表达与DNA甲基化在PANC-1细胞中负相关,而在CFPAC-1细胞中表现出不相关;HOXB5、DDR2、RUNX3基因表达与所检测的DNA甲基化区域不相关;CDH1基因的表达在肿瘤细胞和正常细胞差异明显,其表达与DNA甲基化负相关,因此被选择做进一步分析。2、CDH1基因启动子区DNA甲基化修饰作用为了探究CDH1基因启动子区DNA甲基化修饰在胰腺癌细胞中的作用,将载体CRISPR/dCas9-Dnmt3a与gRNA-CDH1分别共转染PANC-1与CFPAC-1细胞,并利用流式细胞仪筛选出稳定转染细胞。经检测,稳定转染细胞中CDH1启动子区DNA甲基化明显增加,且mRNA表达量明显降低;CDH1启动子区DNA甲基化增加后显著抑制了PANC-1和CFPAC-1细胞的增殖、侵袭、迁移和克隆形成等恶性表型;裸鼠皮下注射稳定转染的细胞PANC-1与CFPAC-1后抑制了体内成瘤率、肿瘤的体积和重量。综上所述,CDH1 mRNA表达与启动子区DNA甲基化水平在胰腺癌细胞PANC-1和CFPAC-1中负相关,利用CRISPR/dCas9-Dnmt3a靶向修饰可明显提高CDH1启动子区DNA甲基化水平,降低其mRNA的表达,并抑制细胞的增殖、迁移、侵袭、平板克隆形成及体内成瘤能力等恶性表型。本研究探讨了胰腺癌早期诊断和治疗的潜在靶点,并为通过特异改变基因位点DNA甲基化水平进行肿瘤治疗提供了研究基础。