鱼类细胞系的建立对水产动物病毒学、环境毒理学、鱼类资源保护与遗传育种、鱼类内分泌学等方面研究具有重要地位与作用。自世界上首株鱼类细胞系即虹鳟(Oncorhynchus mykiss)性腺细胞系RTG-2建立以来,迄今已建立了包括淡水鱼、海水鱼在内的不同组织来源的280余株细胞系,但性腺来源的体细胞系相对稀少。鱼类性腺体细胞包括卵巢的颗粒细胞、鞘膜细胞、间质细胞,及精巢的Sertoli细胞、Leydig细胞等,在生殖细胞的增殖、分化发育方面具有决定性的作用,特别是近年来对生殖干细胞研究的关注,使得性腺体细胞的培养及细胞系的建立尤为必要。研究显示,用斑马鱼(Danio rerio)性腺体细胞作为饲养层,可在体外培养其生殖干细胞达数月之久。南方鲇(Silurus meridionalis Chen)属于鲇形目,鲇科,是主要分布于我国长江中上游的名贵经济鱼类,具有生长速度快、肉质细嫩、适温范围广、抗病性强等优良性状,目前已成为我国重要的养殖鱼类之一。在自然条件下,南方鲇性比约为1：1,有趣的是,在人工繁殖条件下南方鲇后代几乎全为雌性。尽管目前已对此进行了多年的探索,但其具体机制仍有待进一步研究。南方鲇性腺体细胞系的建立可望为生殖细胞特别是生殖干细胞的培养、增殖与分化、功能基因及环境内分泌干扰物的影响等研究提供有力手段。另一方面,近年来,越来越多的报道显示,世界各地水域环境雌激素污染日益加剧,对人及动物的生殖发育异常、恶性肿瘤、代谢紊乱等方面均存在显著影响。实时、高效监测是防治其污染的前提。环境雌激素物质种类多,数量大,含量少,其生物学检测具有不可替代的地位与作用。有报道显示,采用可稳定表达哺乳动物雌激素受体(Estrogen Receptor a, ERa)的真核表达载体pEGFP-ERa与含有四个串联的雌激素受体反应元件(Estrogen Receptor response Element, ERE)的真核表达质粒pGL3-ERE4-luc共转染哺乳动物细胞,从而监测环境雌激素的雌激素活性,该方法具有高效、快捷、灵敏度高等优势。然而,鱼类细胞内环境及相关分子表达与哺乳动物细胞存在显著差异,对环境雌激素的敏感性也明显不同,故上述哺乳动物细胞的检测体系能否反映环境雌激素对鱼类的影响,尚待进一步研究。鉴于此,本研究主要开展了两方面工作,一方面,建立了南方鲇卵巢与精巢体细胞系,并对其生物学特征进行鉴定；另一方面,建立了斑点叉尾鲴(Channel catfish, Ictalurus punctatus)ERa的真核表达载体pEGFP-ccERa,与pGL3-ERE4-luc分别共转哺乳动物细胞与鱼类性腺细胞系,并进行比较分析,以期建立环境雌激素对鱼类影响的高灵敏检测体系。具体如下：(一)南方鲇卵巢与精巢体细胞系的建立及其生物学特征1南方鲇卵巢体细胞系约3月龄南方鲇卵巢组织经胶原蛋白酶IV及胰蛋白酶-EDTA消化,用含15%胎牛血清(FBS)、25mM Hepes、1%非必需氨基酸、0.5mMβ-巯基乙醇、10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、1ng/mL白血病抑制因子(LIF)、500U/mL青霉素及链霉素和5%南方鲇血清的L-15培养基于28℃培养,染色体核型分析、RT-PCR,基因转染等方法对其生物学特征进行鉴定,结果显示：1)卵巢细胞分离培养2-3天后,开始成纤维细胞样生长,约15天后长满单层,用0.25%的胰蛋白酶-EDTA消化,1：2进行传代培养,传代后初期细胞生长较为缓慢,平均7-10天进行传代,传至第9代后,细胞生长加快,平均3-6天进行传代；现细胞经18个月的继代培养,已稳定传至第90代,将其命名为SCO1;2) SCO1在不同培养基(DMEM、L-15、DMEM/F12)、不同血清浓度(5%、15%、25%)、不同温度条件下(18℃、28℃、37℃)进行培养,结果显示,在15%胎牛血清的L-15培养基中28℃进行培养,SCO1生长最佳；3：RT-PCR检测结果显示,SCO1表达Foxl2, Sfl和Wtlb,不表达Vasa、 Wtla、 Cyp19a和Dmrtl,初步推测其为南方鲇卵巢颗粒细胞系；4)对第20、30、70代的SCO1染色体核型分析结果表明,80%以上细胞染色体数为50-65,其中,2n=58的分裂相占62%,并且表现为正常的二倍体核型；5) pIRES-hrGFP-1a质粒用TranlT-2020转染SCO1,24h后可观察到绿色荧光蛋白的表达,至48h,约30%细胞可见目的蛋白表达。2南方鲇精巢体细胞系用上述同样的方法建立了南方鲇精巢体细胞系,细胞形态为成纤维细胞样,目前已培养15个月,稳定传至第56代,将其命名为SCT1;对第19和43代的SCT1染色体数目与核型分析显示,70%以上细胞染色体数为50-65,其中2n=58的分裂相占52%,表现为正常的二倍体核型：RT-PCR分析结果显示,SCT1表达Sf1和Foxl2,不表达Vasa、 Wtla、Wtlb、Cypl9a和Dmrtl; pIRES-hrGFP-la质粒转染SCT1,48h后有约25%细胞表达绿色荧光蛋白。(二)环境雌激素检测体系的建立1RT-PCR克隆并获得斑点叉尾鮰雌激素α受体的cDNA全长序列,成功构建真核表达载体pEGFP-ccERa。2将pEGFP-ccERa与pGL3-ERE4-luc共转HEK293与SCO1,并与人雌激素受体表达载体pEGFP-hERa进行比对,结果显示,pEGFP-hERa在HEK293细胞中对E2的检出限是10-1ommol/L,在SCO1中是10-9mmol/L,而pEGFP-ccERa与之刚好相反,即在HEK293中对E2的检出限是10-9mmol/L,在SCO1中为10-10mmol/L。从而表明,pEGFP-ccERa在鱼类细胞SCO1中检测雌激素的荧光素酶活性大小比pEGFP-hERa具有更高的灵敏度。3相同浓度(10-5mmol/L)的具有不同雌激素样活性大小的17α-甲基睾酮(MT)、17α-乙炔雌二醇(EE2)、雌二醇(E2)、双酚基丙烷(BPA)、壬基酚(NP)、乙烯雌酚(DES)和辛基酚(OP)处理细胞,48h后检测荧光素酶相对活性大小,结果显示,环境雌激素的荧光素酶相对活性大小与其相应的雌激素活性大小相符(即EE2> E2> DES> BPA> OP> NP> MT),从而表明,pEGFP-ccERa可准确检测环境雌激素的雌激素活性大小。综上所述,本研究首次成功建立了南方鲇卵巢、精巢体细胞系,即SCO1与SCT1,并成功构建斑点叉尾细雌激素α受体表达载体pEGFP-ccERa,与pGL3-ERE4-luc共转SCO1,建立了环境雌激素的检测体系。该研究不仅为南方鲇生殖细胞特别是生殖干细胞的培养、功能基因的研究等提供了必要的平台和工具,同时为环境雌激素的检测奠定了重要基础。