论文部分内容阅读
采用硫酸铵沉淀结合DEAE-52及Sephadex G-75柱层析等纯化步骤实现了莲藕中多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO),过氧化物酶(peroxidase,POD),的分离纯化,并通过SDS-PAGE,凝胶过滤层析方法进行了纯度鉴定和分子量测定；采用双水相萃取法,在莲藕中初步纯化了苯丙氨酸解氨酶(phenylalnine ammonialyase,PAL)。研究了莲藕中PPO、POD、PAL的酶学性质,不同化合物,金属离子对其酶学特性的影响,重点研究了乳酸菌豌豆发酵液中防褐变成份对莲藕PPO、POD的抑制作用以及对酶学特性影响,并采用圆二色谱(CD),傅立叶红外光谱(FTIR)研究了其作用后对酶结构的改变。其主要研究结果如下：1.莲藕中PPO, POD, PAL的分离纯化及其基本性质莲藕中的PPO, POD,分别纯化了55.71,30.68倍,蛋白质回收率为1.85%,分子量均为58.3kDa。采用双水相法分离纯化莲藕中的PAL,PAL的纯化倍数为4.1,回收率达到82.7%。莲藕PPO对不同酚类的亲和力,其中多元酚>二元酚>一元酚,最适底物为焦性没食子酸；莲藕POD对愈创木酚的亲和性大于过氧化氢。PAL的最适反应条件是：温度为60℃,pH值为8.8时,酶活性表现最高,以L-苯丙氨酸为底物的最适底物浓度为40mM。2.不同化合物对莲藕PPO、POD活性影响苯甲酸,EDTA-2Na,山梨酸钾对PPO活性无明显抑制作用；AA,柠檬酸,L-半胱氨酸,亚硫酸钠,PHBA,TL对PPO活性抑制作用明显。PHBA高浓度时,对PPO抑制作用明显,而低浓度时,对PPO活性有促进作用。对POD的抑制作用,AA最为显著;柠檬酸、L-半胱氨酸、亚硫酸钠、PHBA的作用不明显。高浓度PHBA对POD无抑制作用,在低浓度时,对POD有一定的抑制作用；TL浓度的增大,对POD的抑制作用越强。3.不同金属离子对莲藕PPO, POD活性影响Al3+, Fe2+, Cu2+, Ca2+, Mg2+, Fe3+, Hg2+, Mn2+对莲藕中PPO活性都有促进作用。但是Mn2+对POD具有较强的抑制作用,Mg2+对其抑制作用较弱；Hg2+在高浓度时能够强烈抑制莲藕POD活性,低浓度时抑制作用不明显。4.亚硫酸钠,AA, TL, PHBA对莲藕PPO、POD酶学特性影响亚硫酸钠抑制PPO作用属于可逆过程,竞争型抑制；抑制常数KI为1.71。AA对莲藕PPO、POD的作用类型都是属于可逆过程,竞争型抑制。对PPO的抑制常数KI为6.17,对POD抑制常数KI为1.64。TL对莲藕PPO的作用类型是可逆过程的竞争型抑制,对莲藕PPO的抑制常数KI为1.5。TL对莲藕POD的作用类型是可逆过程的反竞争型抑制,对莲藕POD抑制常数(KIS)为1.03。PHBA对莲藕中PPO的作用类型是可逆过程中的竞争型抑制,对莲藕PPO的抑制常数KI为0.52。PHBA对莲藕中的POD作用属于可逆过程,在PHBA浓度为0.2-0.6mM区间,其抑制作用机理表现为反竞争性抑制类型,对莲藕POD的抑制常数(KIS)为0.17。5.莲藕PPO、POD的CD、FTIR光谱分析莲藕中PPO、POD通过圆二色谱分析,在190nm附近有一正吸收峰,在206nm和223nm处有两显著的负吸收峰,表明其a-螺旋含量很高,p-折叠较低,进一步通过傅立叶红外光谱分析发现,在酰胺Ⅰ带具有强吸收峰,且在1650cm-1附近吸收最强,表明样品含有大量的α-螺旋和无规则卷曲结构,在1261cm-1附近也出现吸收峰,进一步证明样品中含有无规则卷曲,结果显示莲藕PPO、POD主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,其含量分别是：50.60%的α-螺旋,3.90%的β-折叠,45.50%的无规则卷曲。6.亚硫酸钠,抗坏血酸,TL, PHBA作用于莲藕PPO、POD后其结构的改变亚硫酸钠对莲藕PPO活性有显著的抑制作用,其作用于莲藕PPO、POD后,样品中的α-螺旋含量迅速变小但没消失,β-折叠含量迅速上升,出现少量的β-转角,无规则卷曲变化不大；同样AA处理后,样品中的α-螺旋含量逐渐下降,β-折叠含量先缓慢上升后下降至消失,无规则卷曲含量逐步上升,说明AA浓度越大,对莲藕PPO、POD的作用越强烈,在高浓度时出现了一定量的β-转角；TL作用下,莲藕PPO、POD中α-螺旋含量迅速变小但没消失,β-折叠含量迅速上升,无规则卷曲变化不大,β-转角含量小幅度上升；THBA作用于莲藕PPO,POD,样品中α-螺旋含量逐渐下降,β-折叠含量先迅速上升后逐渐下降至消失,无规则卷曲含量逐步上升,在PHBA浓度较大时,样品中出现β-转角含量迅速上升。亚硫酸钠,AA,TL,THBA四种物质对莲藕中的PPO、POD活性都具有较强的抑制作用,分别作用于莲藕中PPO、POD后,样品中的α-螺旋含量都下降,无规则卷曲含量不变或下降。由此推断莲藕PPO、POD的酶活性中心主要集中在α-螺旋。