【研究背景及目的】肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC,简称肝癌)是世界范围内最常见、恶性程度最高的肿瘤之一,严重影响人民健康和生命。随着医学技术的发展和诊疗水平的提高,HCC的临床诊治取得了很大进展,但总体疗效仍不容乐观。随着研究的不断深入,肿瘤的诱导分化治疗成为实体肿瘤治疗的新方向。肝细胞核因子4α(hepatocyte nuclear factors 4 alpha,HNF4α)是在肝脏优势表达的转录因子,其对肝细胞分化和功能维持起关键作用。我们前期研究发现HNF4ɑ可诱导肝肿瘤细胞向成熟肝细胞分化,显著抑制肝癌细胞增殖,并有效治疗实验性肝癌,从而提出利用细胞分化相关转录因子诱导分化治疗肝癌新策略;但其机制尚未完全阐明。凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1,ASK1)是丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶(mitogenactivated protein kinase kinase kinase,MAP3K)家族重要成员之一,能被各种外来刺激特异性地活化,从而活化下游p38与c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)通路,在细胞分化、凋亡、炎症反应中发挥重要生物学作用。研究表明,ASK1参与了多种肿瘤的发生发展,然而其在肝癌进展的作用尚未见报道。在前期研究的基础上我们利用c DNA芯片筛查发现,HNF4α可上调肝癌细胞中ASK1的表达。同时肝肿瘤细胞中过表达HNF4α可上调ASK1 m RNA及蛋白表达,并且其下游JNK及P38磷酸化蛋白的表达水平明显升高,提示ASK1可能介导了HNF4ɑ的诱导分化作用。本课题旨在探讨ASK1在HNF4α诱导分化中的重要作用和对实验性肝癌的治疗作用及分子机制,为肝癌的临床治疗提供新靶点。【实验方法】一、ASK1在肝癌组织中的表达及其临床意义1.利用RT-PCR检测60例肝癌患者癌和癌旁组织中ASK1及HNF4αmRNA的差异表达,并分析两者的相关性。2.利用该研究队列的临床资料和组织病理学资料,分析ASK1与年龄、是否合并肝硬化、肿瘤大小、肿瘤分期、有无血管侵犯等肝癌临床恶性表型的关系。3.利用组织芯片检测肝癌患者癌和癌旁组织中ASK1蛋白的差异表达,并分析ASK1与肝癌预后的关系。二、ASK1对肝癌细胞恶性生物学行为的影响1.ASK1对肝癌细胞凋亡的影响利用过表达ASK1的腺病毒(AdASK1)上调肝肿瘤细胞株Hep3B及Huh7细胞中ASK1表达,通过流式细胞仪检测肝肿瘤细胞的凋亡率。2.ASK1对肝癌细胞增殖能力的影响将肝肿瘤细胞株Hep3B及Huh7以不同的感染复数(MOI)感染过表达ASK1的腺病毒,或利用针对ASK1的小干扰RNA(si ASK1)下调其表达,之后利用CCK8在不同时间点检测细胞活性,通过绘制生长曲线,观察ASK1对肝癌细胞增殖能力的影响。3.ASK1对肝癌细胞克隆形成能力的影响将过表达ASK1(Ad ASK1)或下调ASK1表达(si ASK1)的肝肿瘤细胞以低密度接种于培养皿,培养2~4周,比较上调或下调ASK1对肿瘤细胞克隆形成能力的影响。4.ASK1对肝癌细胞迁移、侵袭能力的影响将过表达ASK1(AdASK1)或下调ASK1表达(siASK1)的肝肿瘤细胞用无血清培液以3×104细胞/300μl接种到迁移小室上层,下层加入500μl含10%FBS的培液(si ASK1组下层加含2%FBS培液),培养48 h后,棉签轻轻擦去上层细胞,结晶紫染色,显微镜下观察拍照。侵袭实验时Matrigel包被的小室需预先水化。5.ASK1对肝癌细胞体内成瘤能力的影响将肝肿瘤细胞株分别感染过表达ASK1的腺病毒和对照病毒AdRFP,并以一定浓度(Hep3B:5×106,Huh7:2×106)接种于同一只裸鼠两侧腋下。观察测量两侧腋下肿瘤生长情况,评估ASK1对肝肿瘤细胞皮下成瘤能力的影响。三、ASK1治疗实验性肝癌1.Ad ASK1瘤内注射治疗肝癌皮下肿瘤将肝肿瘤细胞株Huh7以2×106/只注射至雄性裸鼠腋下。待肿瘤生长至200~300mm3时将小鼠随机分成两组,分别瘤内注射Ad ASK1和Ad RFP,每组6只,每周注射2次,共6次,观察皮下肿瘤生长情况。2.Ad ASK1尾静脉注射治疗肝脏原位种植瘤将带有荧光素酶基因的肝肿瘤细胞Huh7细胞株以2×106接种于NOD/SCID小鼠腋下,待成瘤后处死荷瘤鼠,分离肿瘤组织标本,处理为体积1 mm3左右瘤块,将之直接种植于NOD/SCID小鼠肝左叶内。种植瘤块约1周后利用小动物活体成像系统进行检测,见小鼠肝内均可见荧光信号,表明瘤块种植成功。将小鼠按瘤块荧光强度配比分为2组,每组8只,通过尾静脉分别注射Ad ASK1及对照腺病毒Ad RFP,每周2次,共3周。实验终点时取出小鼠肝脏组织,剥出瘤块,作组织病理分析。3.ASK1抑制肝癌的分子机制为明确ASK1抑制肝癌生长的分子机制,我们在肝肿瘤细胞株中上调ASK1表达,通过Western Blot检测ASK1及下游p38和JNK通路的表达情况。此外,利用Western Blot检测体内上述两种肝癌模型过表达ASK1后相关通路蛋白表达情况。四、ASK1部分介导HNF4α诱导分化作用1.HNF4α正向调控ASK1在肝肿瘤细胞Hep3B中上调或下调HNF4α,利用RT-PCR检测ASK1 m RNA表达水平的表化;通过Western Blot检测ASK1及下游信号通路蛋白表达水平的变化。2.HNF4α结合在ASK1的启动子区域利用JASPAR软件预测HNF4α和ASK1的结合位点,针对该结合位点,利用染色质免疫共沉淀明确HNF 4α和ASK1的直接结合作用。进一步构建含有该结合位点的ASK1启动子区域报告基因载体,并将该结合位点进行突变,通过检测报告基因的活性证实HNF4α对ASK1启动子区域的转录调控作用。3.ASK1部分介导HNF4α诱导分化作用肝肿瘤细胞株Hep3B感染Ad HNF4α上调HNF4α的同时转染si ASK1下调ASK1的表达,通过CCK8检测细胞增殖、流式细胞仪检测细胞凋亡,并利用RT-PCR检测ASK1下调后HNF4α对肝功能基因表达调控作用的变化。综合评估ASK1下调后HNF4α对肝癌诱导分化作用的影响。五、统计学分析本文中研究数据采用SPSS 16.0统计软件包进行分析。采用Student’s t检验分析两独立样本方差齐性数据;采用Wilcoxon符号秩检验分析方差非齐性的配对资料,而不配对资料采用Mann-Whitney U检验。两样本率的比较采用χ2检验;采用Kaplan-Meier分析分组的生存差异;生存曲线采用log-rank检验;P<0.05为差异具有统计学意义。【实验结果】一、ASK1在临床肝癌样本中的表达及其临床意义1.肝癌组织中ASK1和HNF4α表达下调利用RT-PCR检测60例肝癌患者癌和癌旁组织中ASK1及HNF4αm RNA的差异表达,结果显示,相比癌旁组织,超过70%的肝癌组织中ASK1和HNF4α表达明显下调,且两者呈明显正相关。2.ASK1与肝癌临床恶性表型密切相关根据肝癌组织中ASK1表达的中位数将60例样本分为ASK1低表达组和高表达组,分析ASK1与年龄、是否合并肝硬化、肿瘤大小、肿瘤分期、有无血管侵犯等肝癌临床恶性表型的关系。结果发现ASK1低表达组肿瘤直径更大,分期更晚,包膜缺失的病例数更多。表明ASK1低表达与肝癌恶性表型密切相关。3.ASK1与肝癌预后密切相关利用组织芯片检测肝癌中ASK1蛋白的表达,结果显示,相比癌旁肝组织,61.63%肝癌组织中ASK1表达下调。根据肝癌组织中ASK1表达的中位数将86例样本分为ASK1低表达组和高表达组,分析ASK1与肝癌预后的关系。结果发现,ASK1低表达组肝癌患者的生存期明显短于ASK1高表达组。提示ASK1与肝癌预后密切相关,ASK1表达越低预后越差。二、ASK1对肝癌细胞恶性生物学行为的影响1.ASK1促进肝肿瘤细胞凋亡通过流式细胞仪检测感染了Ad ASK1的肝肿瘤细胞凋亡率,结果显示肝肿瘤细胞过表达ASK1后细胞凋亡率明显高于对照组。2.ASK1抑制肝肿瘤细胞增殖在肝肿瘤细胞株中上调或下调ASK1表达,通过测定生长曲线发现上调ASK1后肝癌细胞增殖明显抑制,反之,下调ASK1可轻度促进肝癌细胞增殖。3.ASK1抑制肝肿瘤细胞克隆形成能力将感染了Ad ASK1腺病毒或si ASK1的肝肿瘤细胞以低密度接种于培养皿,观察细胞克隆形成能力。结果显示过表达ASK1可明显抑制肝肿瘤细胞的克隆形成能力,反之亦然。4.ASK1减弱肝肿瘤细胞的迁移、侵袭能力肝肿瘤细胞株上调ASK1表达后肝癌细胞迁移和侵袭能力明显下降。而下调ASK1表达肝癌细胞的迁移和侵袭增强。5.ASK1抑制肝肿瘤细胞的体内成瘤能力分别感染了AdASK1和AdRFP的Hep3B、Huh7细胞接种裸鼠皮下,Hep3B-Ad RFP组23 d即可触及肿瘤,42 d后5只小鼠均可见肿瘤生长;Huh7-Ad RFP组接种21 d后皮下可触及肿瘤,36 d后4/5只小鼠可触及肿瘤生长。然而,Ad ASK1感染的Hep3B和Huh7细胞组均未出现皮下肿瘤。三、ASK1治疗实验性肝癌1.Ad ASK1瘤内注射治疗肝癌皮下肿瘤裸鼠皮下成瘤后分别瘤内注射Ad ASK1和Ad RFP,相比于注射对照腺病毒Ad RFP,Ad ASK1瘤内注射后肿瘤体积显著减小,肿瘤重量明显减轻。免疫组化结果显示Ad ASK1治疗组瘤组织中Ki67阳性细胞比例减少,TUNEL阳性细胞增多。2.AdASK1尾静脉注射治疗肝脏原位种植瘤小鼠肝脏原位种植Huh7成瘤的瘤块后经尾静脉注射Ad RFP和Ad ASK1。活体成像显示Ad ASK1组荧光明显弱于对照组。处死小鼠后肝脏大体观察可见,Ad RFP组8只小鼠肝脏均有较大肿瘤生长,而Ad ASK1组1/8只小鼠肝脏未见肿瘤生长,2/8只小鼠肝脏可见极小的肿瘤。Ad ASK1组瘤块重量明显轻于Ad RFP组。免疫组化结果显示Ad ASK1治疗组瘤组织Ki67阳性细胞比例减少,TUNEL阳性细胞增多。3.ASK1抑制肝癌的分子机制体外肝肿瘤细胞株Hep3B和Huh7过表达ASK1后下游p-p38表达明显增加;体内小鼠皮下种植瘤和肝脏原位种植瘤模型中也发现瘤内或尾静脉注射Ad ASK1后ASK1过表达同时伴随p-p38蛋白表达水平的升高。此外,利用p38抑制剂SB202190抑制p38的磷酸化,可以部分拮抗ASK1抑制肝癌细胞增殖作用。表明ASK1主要通过调控下游p38蛋白的磷酸化发挥作用。四、ASK1部分介导HNF4α诱导分化作用1.HNF4α正向调控ASK1在肝肿瘤细胞Hep3B中上调或下调HNF4α的表达,ASK1m RNA和蛋白表达水平随着HNF4α表达上调而增加,反之,当HNF4α表达下调后ASK1 m RNA和蛋白表达水平下降。此外,过表达HNF4α后ASK1的下游p38磷酸化蛋白水平升高,而同时下调ASK1后,升高的磷酸化p38蛋白水平有所下降。2.HNF4α结合在ASK1的启动子区域软件预测HNF4α可以和ASK1的启动子相结合,染色质免疫共沉淀明确HNF 4α与ASK1的直接结合作用。通过检测含有结合位点的报告基因活性证实HNF4α可以激活ASK1启动子区域的相对活性。3.ASK1部分介导HNF4α诱导分化作用肝肿瘤细胞株Hep3B感染Ad HNF4α上调HNF4α表达的同时转染si ASK1下调ASK1的表达,结果显示下调ASK1能部分逆转HNF4α抑制肝癌细胞增殖、诱导细胞凋亡作用,此外ASK1下调还能减弱HNF4α对肝功能基因表达的上调作用。【结论】1.ASK1在肝癌组织中低表达,且其与肝癌的临床恶性表型和预后密切相关。2.ASK1在体外可抑制肝肿瘤细胞增殖和克隆形成能力,促进肝肿瘤细胞凋亡,并减弱其迁移和侵袭能力。3.ASK1在体内可显著抑制实验性小鼠肝癌生长,有望成为肝癌治疗的新靶点。4.ASK1主要通过调控p38的磷酸化发挥抑制肝癌作用,同时部分介导了HNF4α对肝癌细胞的诱导分化作用。