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1.目的免疫性血小板减少性紫癜(immune thrombocytopenic purpura, ITP)是一种以血小板减少和皮肤粘膜出血为特征的自身免疫性疾病。其发病与免疫失调关系密切,但导致免疫功能异常的调控因素仍未完全阐明。临床上应用糖皮质激素、脾切除术等治疗可使70%以上病例血小板数量维持在安全范围,但还有约30%病例此方案治疗无效,需进一步采用其它治疗措施来维持血小板数量在安全水平,防止严重出血。应用糖皮质激素和脾脏切除术治疗无效的病例为难治性ITP (refractory immune thrombocytopenic purpura, RITP)。本研究用外源性抗体注入小鼠体内免疫的方法建立ITP小鼠模型,用益髓颗粒进行干预研究,观察ITP小鼠外周血血小板、骨髓巨核细胞、细胞因子、脾脏和胸腺细胞凋亡指数及凋亡基因表达、脾脏调节性T细胞等指标进行研究,试图从免疫网络调控角度阐明“益髓颗粒”治疗ITP效应机制。2.方法制备豚鼠抗Balb/C小鼠血抗小板血清,予红细胞吸附后备用。造模前将20只Balb/C小鼠依据外周血血小板数随机分正常组、模型组。模型组按照100μ1／20g剂量向小鼠腹腔内注入1：4稀释的GP-APS,隔日一次,造模两周后,检测外周血小板计数、骨髓巨核细胞数量及形态分类,观察胸腺及脾脏病理学改变,以判定疾病模型是否成功。ITP疾病动物模型建立成功后,按血小板计数将70只Balb/C小鼠随机分为正常组、模型组、醋酸泼尼松治疗组、升血小板胶囊治疗组、益髓颗粒大、中、小剂量治疗组,于造模第8天开始各组均按0.2m1／10g体重分别予生理盐水及治疗药物灌胃,每日1次,共7天。通过观察造模小鼠外周血小板计数、骨髓巨核细胞数量及形态分类、血小板相关抗体、脏器指数及免疫组织器官病理学变化等指标,评价益髓颗粒治疗效果。在确定疗效后,我们按上述造模方法建立ITP,用大剂量益髓颗粒为治疗药进行干预,用ELISA检测与免疫密切相关的Th1/Th2细胞因子(IFN-y/IL-4)及TGF-β1, TUNEL法及免疫组化法分别检测脾脏和胸腺细胞凋亡指数及凋亡基因Bcl-2、Bax的表达,用流式细胞仪检测脾脏调节性T细胞等指标进行研究,探讨益髓颗粒治疗ITP可能的免疫调控机制。3.结果3.1 ITP小鼠模型的建立GP-APS稀释倍数为1：128时仍成阳性,说明豚鼠血清中已产生了特异性抗体,即豚鼠抗Balb/C小鼠血小板抗体。与正常组及造模前比较,ITP小鼠模型外周血血小板明显降低,差异显著有统计学意义(P<0.05,P<0.01),注射APS后24小时模型小鼠外周血小板数最低。模型组小鼠骨髓巨核细胞总数明显增加,而产板巨核细胞减少,与正常组比较,差异显著有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。模型组凝血时间明显延长,与正常组比较,差异显著有统计学意义(P<0.001)。模型组小鼠脾脏指数明显大于正常组,差异显著有统计学意义(P<0.001),胸腺指数与正常组比较差异不显著无统计学意义。3.2益髓颗粒对ITP小鼠模型治疗作用的实验研究与模型组比,各治疗组血小板数均比模型组有所升高,差异显著有统计学意义(P<0.01,P<0.001),以益髓颗粒大剂量组和泼尼松组血小板升高明显。益髓颗粒大剂量组不成熟的骨髓巨核细胞增生受到抑制,产板巨核细胞增多,与模型组比较,有统计学意义(P<0.01,P<0.001)；模型组PAIgG水平明显升高低,与正常组比差异显著有统计学意义(P<0.001),经治疗后,益髓颗粒组PAIgG水平明显低于模型组,与正常组比差异不明显无统计学意义。与模型组比,各治疗组脾脏均有所缩小,脾脏指数降低,差异显著有统计学意义(P<0.001),以益髓颗粒大剂量组效果明显。3.3益髓颗粒对ITP小鼠免疫网络调控机制的实验研究与正常组相比,模型组小鼠IFN-y水平明显升高,IL-4水平明显降低,IFN-γ/IL-4比值升高,Th1/Th2细胞间失衡,提示ITP小鼠存在细胞免疫功能低下及T细胞亚群漂移,表现为Thl细胞优势；Treg细胞比例、TGF-β1水平明显降低,脾脏淋巴细胞凋亡减少,Bcl-2蛋白表达增多,Bax蛋白表达减少,各组胸腺淋巴细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白差异不明显无统计学意义。而经治疗后ITP小鼠血清INF-y水平降低,IL-4水平长高,IFN-y/IL-4比值降低,与模型组比较,益髓颗粒治疗组的IFN-y降低,IL-4升高,IFN-γ/IL-4比值接近正常；Treg细胞比例及TGF-β1水平均有所提高,但Treg仍未达到正常水平,与正常组比仍存在差异,而TGF-β1与正常组比差异不明显无统计学意义；益髓颗粒组脾脏淋巴细胞凋亡增多,Bcl-2蛋白表达减少,Bax蛋白表达增多。4.结论4.1成功制备了GP-APS,IPT小鼠疾病模型建立成功,模型小鼠外周血小板下降、骨髓巨核细胞增多并伴成熟障碍,与ITP临床表现基本相符。4.2益髓颗粒能有效恢复ITP小鼠的血小板计数,并能促进骨髓巨核细胞向成熟方向分化,与醋酸泼尼松疗效相当。4.3 ITP存在细胞免疫功能低下及T细胞亚群漂移,表现为Thl细胞优势,其发病可能与Th1/Th2细胞间细胞因子失衡,Treg细胞及TGF-β1含量降低,淋巴细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达异常等相关。益髓颗粒可能通过调节Th1/Th2细胞间的平衡,促进Treg细胞增殖及TGF-β1分泌,并能调节脾脏淋巴细胞凋亡及凋亡基因Bcl-2、Bax的异常表达,进而调节ITP免疫异常,降低血小板相关抗体,减少血小板破坏,提高血小板数量,促进骨髓巨核细胞向成熟方向分化而达到治疗效果。