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1.本研究比较了不同类型血清、不同来源的激素以及大卵泡液对牛卵母细胞体外成熟的影响。 在无大卵泡液存在时，成熟培养液中添加发情牛血清（OCS）和胎牛血清（FBS），卵母细胞的体 外成熟率显著高于添加新生牛血清（NCS）时的成熟率（83.1％，82.9％比53.0％，P＜0.01）；在培 养液中添加3％大滤泡液（BFF）时，OCS和FBS内卵母细胞的成熟率明显高于NCS内的成 熟率（85.1％，83.5％比57.7％，P＜0.01）。结果表明：本实验条件下，OCS和FBS可以显著提 高卵母细胞的成熟率，而NCS不适合于牛卵母细胞的体外成熟；BFF添加与否不影响卵母 细胞的成熟率。在培养液中添加低纯度的FSH（10μg/ml）和LH（20μg/ml）或高纯度的 HMG（含0.075U/ml FSH+0.075U/ml LH）对牛卵母细胞体外成熟无显著的差异。2.比较了几种不同的化学激活方法对牛卵母细胞激活的影响，为体细胞核移植胚胎的激活确立 激活条件。选择明显具有第一极体的成熟卵母细胞，随机分为以下9组：（1）.Ionomycin（I）+ DMAP（D）（ID）；（2）.I+D+CCB（C）（IDC）；（3）.I+CHX（X）（IX）；（4）.I+X+C（IXC）；（5）.7％乙醇（E）+ D（ED）；（6）.E+D+C（EDC）；（7）.E+X（EX）；（8）.E+X+C（EXC）；（9）.Sr2++C（SC）。Ionomycin和7％ 乙醇处理时间为5min；DMAP±CCB处理时间为4h；放线菌酮（CHX）±CCB处理时间 为5h；Sr2++CCB处理时间为10h。体外培养24h后，前8组卵裂率在53.0％-64.6％间，大 多无明显差异，但均明显高于SC组的卵裂率（30.1％）；培养36h后，各组的卵裂率分别为 72.0％、75.5％、81.3％、85.1％、81.7％、82.4％、74.4％、78.1和％51.0％；IX、IXC、ED、 EDC组卵母细胞的卵裂率明显高于ID、IDC、EX组，SC组显著低于其它各组，表明在10mM Sr2++CCB内培养10h不能有效地激活牛卵母细胞。培养到第8天时，各组的囊胚发育率分 别为18.2％、24.5％、7.2％、11.9％、11.1％、19.4％、6.7％、12.2％和2.0％，ID、IDC和EDC 组内囊胚发育率显著高于IX、IXC、ED、EX、EXC和SC组。结果表明Ionomycin与DMAP ±CCB以及7％乙醇与DMAP+CCB结合使用可以有效地激活牛卵母细胞。Ionomycin对牛 卵母细胞的激活作用比乙醇强烈；而6-DMAP的激活效果比CHX的激活效果好，激活液中 CCB的存在对孤雌生殖胚胎的发育有利。在0.2mM DMAP内培养的卵母细胞，囊胚发育率 低于2mM DMAP内培养的卵母细胞，表明低浓度的6-DMAP不能充分激活牛卵母细胞。3.体外成熟的牛卵母细胞经5μM Ionomycin内5min和2mM 6-DMAP+5μg/ml CCB内4h 激活后，分别在TALP+M199（1∶2）（TM）、BMOC+M199（1∶2）（BM）和CR1aa内培养，24h 和36h后各组间卵裂率无显著差异；培养8天后囊胚发育率分别为18.2％、21.4％和 29.3％。孤雌激活卵母细胞在CR1aa内的囊胚发育率显著高于TM内的发育率（P＜0.01）， 但与BM内的孤雌激活卵母细胞间无明显差异。结果表明CR1aa和BM较适合孤雌激活 卵母细胞的体外培养，培养液中添加EGF和ICF对孤雌激活卵母细胞的卵裂和体外发育 无明显影响。Hoechst 33342染色和UV照射对孤雌卵母细胞的卵裂和体外发育产生负面 的影响，且对卵母细胞的卵裂影响尤为明显。 牛卵母细胞孤雌激活与体细胞核移植一4．利用常规的组织培养技术，建立了3头良种奶、肉牛耳缘皮肤成纤维细胞的传代细胞，为体 细胞核移植提供了充足的供体细胞。用含8％DMSO的血清作冷冻液，采用简化的细胞冷冻 方法冷冻保存了皮肤成纤维细胞。5．通过电融合法或细胞质内注射法将供体细胞核移入体外成熟22～23 h去核的卵母细胞内， 重组胚经 Ionomycin和 6－DMAP（或加 CCB）激活后，转入不同的培养系统内进行培养。以牛 皮肤成纤维细胞为核供体细胞，比较融合法和细胞质内注射法进行核移植的差异，结果融合 法构建重组胚的效率显著低于细胞质内注射法；重组胚培养36 h后卵裂率相同，培养8天 后囊胚发育率无显著差异；但相对于操作的卵母细胞总数而言，前者得到的囊胚发育率显著 低于后者，表明用细胞质内注射法进行体细胞核移植效率更高。采用细胞质内注射法进行核 移植，卵丘细胞作供体时，显微操作后卵母细胞的存活率显著低于皮肤成纤维细胞做供体时 的存活率（刀．5％比87．o％）；重组胚培养36 h后，前者的卵裂率显著高于后者（77．8％比7O．8％， 卜0．05）：两种类型的供体细胞所构建的重组胚的囊胚发育率无显著差异(16．5％比11．9叨。 研究发现来自不同个体的皮肤成纤维细胞所构建的重组胚，卵裂率和囊胚发育率无差异。6．应用细胞质内注射法和lonomycin与6－DMAPteCB协同激活法进行核移植，卵丘细胞作供 体时，BMM＋MI99（BM）内培养的重组胚，24 h和 36h的卵裂率显著高于 TALP＋M199（TM） 内培养的重组胚(58．0％比39．8o：78．6％比55．6％，