论文部分内容阅读
家蚕是重要的经济昆虫,其最大的经济价值来源于其泌丝器官——丝腺,因此它也是家蚕研究中最受关注的部分之一。家蚕丝腺在整个幼虫期呈现一个周期性发育变化过程,即腔内丝蛋白和内壁细胞层在眠期降解,在盛食期重新合成。丝蛋白的周期性降解是丝腺发育中重要的一环,有证据显示丝蛋白的降解过程很可能受到丝素酶的调控。因此,阐明丝素酶在丝腺发育过程中参与的调控作用,有利于构建丝腺发育过程中的丝蛋白稳定/降解的调控网络,对研究昆虫变态发育过程中的组织降解机制具有重要意义。本研究以丝素酶为中心,通过生物信息学分析、遗传操作、生物化学与分子生物学等多种实验方法,从体外到体内、从细胞到个体多个层面上研究了家蚕丝素酶的生理功能及其参与丝腺发育的调控机制。本研究获得的主要成果如下:1、丝素酶参与丝腺发育的调控我们利用RNA干涉的方法,证明了丝素酶的主要功能是参与丝腺及其内容物的降解与凋亡。时空表达谱则向我们展现了丝素酶参与丝腺发育的过程:在家蚕幼虫的2-4龄,丝素酶的表达变化整体较为稳定,平时以较低的表达量参与丝腺的正常代谢及泌丝（主要是保障前部丝腺不阻塞）,眠起时以较高的表达量参与到丝腺组织的生长更新和丝腺腔内残余丝蛋白的分解利用;进入5龄后,丝素酶表达量大幅下降,从而保障丝腺的快速生长,为上蔟做相应准备;5龄末期,丝素酶表达量开始回升,并维持相对稳定直至吐丝完毕,此时丝素酶主要负责丝腺的快速代谢及保障前部丝腺泌丝顺畅;上蔟结束后,家蚕进入预蛹期,丝素酶表达量大幅上升,以协助丝腺的快速调亡。2、抑制剂通过调控丝素酶的活性间接地参与了丝腺发育为进一步研究丝素酶的生化活性并鉴定其生理抑制剂,我们通过酵母表达的方式获取了丝素酶活性蛋白。生化活性分析显示,丝素酶是一类典型的半胱氨酸蛋白酶,它催化的最适pH环境是酸性（pH 4.0）,这与丝腺的内环境相近;丝素酶最适反应温度是42℃。其降解多肽底物的酶活动力参数分别为Km=9.13μM,Vmax=16.39 nM/s。本实验室之前的研究发现,Serpin 18是丝素酶的生理抑制剂之一。而分析丝腺的蛋白质组学鉴定数据表明,半胱氨酸蛋白酶抑制剂BCPI也能够与丝素酶一同在丝腺中被鉴定到。因此我们重组表达并纯化了BCPI,并测定BCPI对丝素酶的抑制效果及抑制方式。结果表明,BCPI是丝素酶强效的生理抑制剂,其对丝素酶的理论抑制摩尔比为1.2;BCPI与丝素酶形成非共价的复合体,从而抑制了丝素酶的活性。BCPI、Serpin 18和丝素酶的时空表达特征显示,BCPI和Serpin 18的主要功能是预防5龄期及上蔟前期丝素酶对丝蛋白及丝腺内壁组织的降解,其中Serpin 18主要在5龄前中期发挥作用,BCPI主要在5龄末期到上蔟前期发挥作用,二者以接力的形式共同调控丝素酶的活性并影响丝腺的发育。3、丝素酶对丝腺发育的调控受蜕皮激素影响我们通过激素诱导实验,证明了丝素酶的表达受蜕皮激素诱导上调,而基本不响应保幼激素的信号。对丝素酶启动子区进行的克隆、截短与活性分析结果显示,BmAbd-B、BmAntp、BmBrc-Z2和BmPOU-M2等转录因子可能参与了丝素酶的转录调控。进一步的细胞、个体及体外实验证明,在蜕皮激素的诱导下,上调丝素酶表达的转录因子BmAbd-B和BmPOU-M2增加,而下调丝素酶表达的转录因子BmBrc-Z2减少,丝素酶的表达量因此提高,最终导致丝腺的周期性发育变化。