缺血性心脏疾病是严重威胁着人类健康,其病理特点是血管的狭窄或阻塞,导致病理血管附近的心肌组织缺血坏死。现代医学对于缺血性心脏病的治疗重在快速建立有效循环,挽救可逆性心肌组织,最大程度的保护心脏的“泵血”能力,降低致死率。目前,由于经皮冠脉内介入治疗、冠状动脉旁路移植术等治疗有创伤性,以及在弥漫性病变患者中上述治疗方法存在局限性,治疗性血管再生术已成为治疗缺血性疾病领域的研究新方向。虽然大量临床和基础实验的都在不断提高治疗性血管再生术的疗效,但其疗效的稳定性、安全性以及可操作性、药物性价比都是摆在研究者面前的难题。　　按照中医理论对心梗病理病机的认识,心气虚是其最常见和最早出现的证候。有学者认为不同程度的心肌梗死患者都有心气虚存在,心功能低下与心气虚密切相关。黄芪甲苷IV是从传统益气中药黄芪中提取的一种皂苷类的单体,是黄芪的主要有效成分,且被广泛应用于治疗缺血性疾病。且有学者通过体外血管内皮细胞实验已初步证实黄芪甲苷IV可通过活化PI3K-AKT信号通路激活Hif-1α,从而促进血管内皮细胞的增殖和体外管腔的形成。但黄芪甲苷IV治疗心肌梗死的作用、对血管新生与成熟的影响以及其与Hif-1α机制的相关性尚不明确。据此,故本实验以益气法理论为基础,采用中西医结合的思考路线,研究具有益气药功效的黄芪的有效成分黄芪甲苷IV是否通过上调Hif-1α的表达促进心梗周边组织血管的新生和成熟来促进心梗的恢复。我们的研究旨在为治疗性血管再生术的研究开辟新视角。　　实验一黄芪甲苷IV对心肌梗死小鼠的治疗作用　　1.目的　　研究黄芪甲苷IV对心肌梗死小鼠的治疗作用。　　2.方法　　(1)建立小鼠心梗模型后,每日腹腔注射给药,并记录小鼠生命体征,21天后通过小鼠心动超检测小鼠心功能的变化.　　(2)Masson三色染色法检测心肌梗死后小鼠的心肌纤维化的程度。　　(3)CD31、α-SMA荧光染色观察梗死周边心肌组织新生血管的变化.　　(4)鼠尾注射生物标记素Lectin后取材切片行荧光染色观察梗死周边心肌组织新生血管的灌注情况。　　(5)Western blot检测心肌组织Hif-1α和VEGF蛋白表达的变化。　　3.结果　　(1)黄芪甲苷IV对小鼠心功能的影响:心动超声图提示:与心梗对照组比较,每日腹腔注射黄芪甲苷IV可提高心梗小鼠的左心射血分数(61±2.7％)和左心室短轴收缩率(44±.3.2%),且差异具有明显统计学意义(P<0.01)。　　(2)黄芪甲苷IV对小鼠心肌纤维化的影响:与心梗对照组纤维化面积(17.5±2.3%)比较,每日腹腔注射黄芪甲苷IV治疗组小鼠心肌纤维化面积(7.8±2.4%)减小,且差异具有明显统计学意义(P<0.01)。　　(3)黄芪甲苷IV对心梗组织周边新生血管的影响:与心梗对照组比较,每日腹腔注射黄芪甲苷IV可显著提高CD31阳性的小血管的密度(214±21.3/mm2)以及有平滑肌细胞被覆的CD31和α-SMA双阳性的成熟血管的密度(7±2.1/mm2)且差异具有明显统计学意义(P<0.01)。　　(4)黄芪甲苷IV对心梗周边心肌组织中血管灌注能力的影响:与心梗对照组(0.19±0.07×104/pixels)比较,每日腹腔注射黄芪甲苷IV可显著提高生物标记素Lectin阳性的有灌注能力的血管密度(0.39±0.11×104/pixels),且差异具有明显统计学意义(P<0.01)。　　(5)黄芪甲苷IV对心梗后心肌组织Hif-1α和VEGF蛋白表达的影响:与心梗组比较,黄芪甲苷IV可上调梗死周边心肌组织Hif-1α和VEGF蛋白的表达,且差异具有统计学意义(P<0.01)。　　4.结论　　(1)黄芪甲苷IV治疗后可提高小鼠的左心射血分数和左心室短轴收缩率,提高心脏功能,减小心梗小鼠心肌纤维化程度。　　(2)黄芪甲苷IV治疗后可增加梗死心肌周边心肌组织新生血管的密度及有平滑肌细胞被覆的成熟血管的密度,且可提高有灌溉能力的血管密度。　　(3)黄芪甲苷IV可促进梗死心肌周边组织中Hif-1α和VEGF蛋白的表达。　　实验二黄芪甲苷IV对缺氧内皮细胞活性和形成管腔能力的影响　　1.目的　　观察黄芪甲苷IV对缺氧内皮细胞活性和形成管腔能力的影响。　　2.方法　　(1)MTT检测不同浓度黄芪甲苷IV对缺氧内皮细胞活性的影响。　　(2)流式细胞术进一步检测黄芪甲苷IV对缺氧内皮细胞周期和凋亡的影响。　　(3)体外平面管腔实验检测黄芪甲苷IV对缺氧内皮细胞管腔形成能力的影响。三维磁珠管腔形成实验进一步检测黄芪甲苷 IV对缺氧内皮细胞管腔形成能力的影响。　　(4)Western blot检测黄芪甲苷IV对缺氧内皮细胞Hif-1α和VEGF蛋白表达的影响。　　3.结果　　(1)不同浓度黄芪甲苷IV在对缺氧脐静脉内皮细胞活性的影响:从0.125μΜ到0.5μΜ随着浓度的提高,与对照组相比,黄芪甲苷IV可提高缺氧内皮细胞的活性,且差异具有统计学意义(P<0.01)。　　(2)黄芪甲苷IV对缺氧脐静脉内皮细胞细胞增殖和凋亡的影响:与对照组比较,黄芪甲苷IV处理组缺氧血管内皮细胞处于G2和S期的比值明显增大,且差异具有统计学意义(P<0.01);且与对照组比较,黄芪甲苷IV处理组缺氧的血管内皮细胞中早期凋亡和晚期凋亡的细胞比例数都明显减少,且差异具有统计学意义(P<0.01)。　　(3)黄芪甲苷IV对缺氧脐静脉内皮细胞管腔形成能力的影响:缺氧条件下,缺氧组内皮细胞管腔形成能力明显下降,但在黄芪甲苷IV处理后,缺氧血管内皮细胞形成管腔的数量(18±3.1/field)明显提高,且差异具有统计学意义(P<0.01)。且三维管腔形成实验进一步提示:与对照组比较,在黄芪甲苷IV处理后,缺氧内皮细胞通过出芽形成管腔的密度(7±1.7/beads)明显提高,且差异具有统计学意义(P<0.01)。　　(4)黄芪甲苷IV对缺氧脐静脉内皮细胞Hif-1α和VEGF蛋白表达的影响:与对照组比较,黄芪甲苷IV处理组可显著提高缺氧内皮细胞Hif-1α和VEGF蛋白的表达,差异具有明显的统计学意义(P<0.01)。　　4.结论　　(1)黄芪甲苷IV可抑制缺氧内皮细胞的凋亡,促进其增殖。　　(2)黄芪甲苷IV可促进缺氧内皮细胞形成血管管腔。　　(3)黄芪甲苷IV在可上调缺氧内皮细胞Hif-1α和VEGF蛋白的表达。　　实验三黄芪甲苷IV抑制缺血心肌细胞损伤的Hif-1α信号机制　　1.目的　　研究黄芪甲苷IV抑制缺血心肌细胞损伤的Hif-1α信号机制。　　2.方法　　(1)原代心肌细胞的提取和培养;LDH的测定黄芪甲苷IV和Hif-1αsiRNA对缺血心肌细胞的保护作用。　　(2)流式细胞术检测黄芪甲苷IV和Hif-1α siRNA对缺血心肌细胞的凋亡的影响。　　(3)Quantitative PCR和Western blot检测黄芪甲苷IV和Hif-1αsiRNA对缺血心肌细胞Hif-1α和VEGF蛋白表达水平的影响。　　3.结果　　(1)黄芪甲苷IV对缺血心肌细胞凋亡的影响:与缺血对照组(34.3±3.7%)比较,黄芪甲苷IV处理组后,缺血心肌细胞的凋亡可减少(17.8±2.8%),且差异具有统计学意义(P<0.01);对细胞进行Hif-1αsiRNA转染后,与转染非特异siRNA对照组比较,缺血细胞的凋亡有增加趋势,但差异无明显统计学意义。但在加入黄芪甲苷IV处理后,与转染Hif-1αsiRNA(35.6±3.4%%)对照组比较,缺血细胞的凋亡无明显减少,且差异不具有统计学意义。　　(2)黄芪甲苷IV对缺血心肌细胞LDH释放量的影响:与缺血对照组比较,黄芪甲苷IV处理组可降低LDH释放,差异具有统计学意义(P<0.01);对细胞进行Hif-1αsiRNA转染后,与转染非特异siRNA对照组比较,缺血细胞的LDH释放有增加趋势,但差异无明显统计学意义,但在加入黄芪甲苷IV处理后,与转染Hif-1αsiRNA对照组比较,LDH释放无明显减少,且差异不具有统计学意义。　　(3)黄芪甲苷IV对缺血心肌细胞Hif-1α和VEGF mRNA和蛋白表达的影响:与缺血对照组比较,黄芪甲苷IV处理组可上调Hif-1α和VEGF mRNA和蛋白,差异具有统计学意义(P<0.01)。对细胞进行Hif-1αsiRNA转染后,与转染非特异siRNA对照组比较,Hif-1α和VEGF mRNA和蛋白明显下调,差异具有统计学意义(P<0.01),而且在加入黄芪甲苷IV处理后,与转染Hif-1α siRNA对照组比较,Hif-1α和VEGF mRNA和蛋白无明显上调,且差异不具有统计学意义。　　4.结论　　黄芪甲苷IV在缺血条件下可抑制心肌细胞的凋亡,减少LDH的释放,保护心肌细胞,但是在转染了Hif-1αsiRNA可抵消黄芪甲苷IV抑制缺血心肌细胞损伤作用。