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α-半乳糖苷酶是一种能够催化水解各类以α键结合的非还原性末端α-半乳糖苷化合物的外切糖苷水解酶。本研究的主要目的是利用分子生物学技术和手段,构建并表达热稳定性好,酶活高的α-半乳糖苷酶重组基因酵母工程菌。本研究将Neosartorya fischeri P1α-半乳糖苷酶Gal A基因序列进行全基因人工合成,并连接到酵母表达载体pAO815上,构建了α-半乳糖苷酶重组表达质粒pAO-Gal A,随后成功将重组表达载体电转入毕赤酵母中进行表达。表达的α-半乳糖苷酶Gal A的最适pH为4.5,最适温度为50℃;单拷贝的α-半乳糖苷酶Gal A平均酶活达到55.74U/mL。终浓度20 mmol/mL的Fe Cl2可以大幅提高α-半乳糖苷酶的酶活。之后又成功构建了α-半乳糖苷酶两拷贝和三拷贝重组表达质粒,并转入酵母中进行了表达。两拷贝的α-半乳糖苷酶重组表达菌株的α-半乳糖苷酶酶活达到95.22 U/mL,比单拷贝菌株酶活提高70.83%;而三拷贝重组表达菌株发酵液平均酶活为35.93 U/mL,比单拷贝菌株酶活降低35.54%。本研究还构建了4种与内质网分泌蛋白相关基因与α-半乳糖苷酶基因共表达的重组表达菌株,结果显示HAC1-Gal A共表达重组菌株的平均酶活为64.24 U/mL,PDI-Gal A共表达重组菌株平均酶活68.7 U/mL,Ero1-Gal A共表达重组菌株平均酶活70.71 U/mL,分别比α-半乳糖苷酶单拷贝重组表达菌株酶活提高15.25%、23.25%和26.86%。Hsp40-Gal A共表达重组菌株平均酶活30.67 U/mL,比α-半乳糖苷酶单拷贝重组表达菌株酶活降低了44.99%;将两拷贝重组表达菌株小摇瓶发酵酶活最高的菌株进行14 L水平的发酵罐高密度发酵,发酵120 h的上清液稀释40倍后,α-半乳糖苷酶酶活达到791.23 U/mL。加入终浓度20 mmol/mL的FeCl2到反应体系中时,酶活达到1400U/mL。本研究的意义:通过利用分子生物学技术和手段构建并表达热稳定性好,酶活高的α-半乳糖苷酶重组基因酵母工程菌,提高α-半乳糖苷酶的表达量,降低生产成本,为α-半乳糖苷酶的工业应用提供优良的候选酶。