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1型鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus type 1,DHAV-1)属于小RNA病毒科,禽肝病毒属,主要引起1~3周龄雏鸭发生鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis,DVH),致死率高达90%。DHAV-1感染雏鸭后引起多个脏器的细胞发生凋亡,特别是肝脏细胞的大量急性凋亡与特征性肝脏出血性坏死,给养鸭业带来巨大的经济损失。内质网(endoplasmic reticulum,ER)是真核细胞的蛋白工厂,主要负责蛋白的正确折叠与加工,也是病毒复制的主要场所之一。在病毒复制过程中,会产生大量的病毒蛋白,当它们不能被正确的折叠修饰和及时输出时,可启动内质网应激反应(ER stress response,ERSR),进而诱导未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR),恢复其稳态。自噬发挥类似ERS的补充机制,可降解细胞中的蛋白质和废物等,维持稳态的细胞过程。ERS在许多病毒感染中发挥作用,不仅与病毒增殖和细胞凋亡有关,而且还可以调控细胞自噬水平。本研究主要针对DHAV-1感染后诱导的ERS及其介导的自噬、凋亡的分子机制进行研究,为进一步揭示DHAV-1感染的致病机理提供理论基础。本研究主要分为以下五个部分:1.DHAV-1感染DEF细胞的定量蛋白组分析本研究利用TMT定量蛋白质组学技术对DHAV-1感染鸭胚成纤维(duck embryo fibroblast,DEF)细胞48h的细胞进行蛋白表达谱分析,结果共鉴定到5250个蛋白质,4573个蛋白具有定量信息。以1.3倍为变化阈值,t-test p-value<0.05为标准,共获得507个差异蛋白,包括171个上调蛋白和336个下调蛋白。生物信息学分析显示,差异蛋白主要与细胞骨架、免疫应答、应激反应、信号转导及能量代谢等功能相关。此外,本研究显示热休克蛋白家族(如Heat shock protein family B member 8,Hspb8)、包括三联基序蛋白25(Tripartite motif containing 25,TRIM25)、黑色素瘤分化相关基因5(melanoma differentiation associated gene 5,MDA5)等在内的免疫相关蛋白、以及激活转录因子(Activating transcription factor 3,ATF3)等显著上调,而核糖体蛋白家族(如Ribosomal protein L35a,RPL35A)、溶酶体和自噬体相关的蛋白等多呈表达下调。KEGG通路富集结果显示,溶酶体、吞噬体以及RIG-1样受体通路等显著富集。蛋白互作结果显示核糖体蛋白与参与应激的蛋白及免疫调控相关蛋白形成一个互作网路。以上结果提示DHAV-1感染可能引起大量的蛋白或错误折叠蛋白堆积在ER,并诱导ERSR,且在病毒感染中伴随着自噬与免疫等过程。选取8个差异蛋白进行平行反应监测(parallel reaction monitoring,PRM)技术靶向验证及Western blot验证,结果显示这些蛋白的表达趋势与蛋白质组分析结果一致,说明本研究蛋白组学数据是可靠的。因此,根据蛋白组学的分析结果,本研究以ERSR为出发点,进行具体的信号通路研究。2.DHAV-1感染诱导ERSR本研究通过透射电镜观察DHAV-1感染细胞后ER形态的变化,结果显示DHAV-1感染DEF细胞后可以引起ER发生明显的肿张,初步说明DHAV-1可诱导ERSR。利用RT-qPCR检测DHAV-1感染后不同时间点葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)的表达情况,结果发现DHAV-1感染显著上调GRP78的表达,并呈现时间依赖性,进一步说明DHAV-1感染能够诱导ERSR。Western blot结果显示DHAV-1感染诱导DEF细胞和乳仓鼠肾细胞(baby hamster kidney cell line 21,BHK-21)的GRP78蛋白水平的表达上调,进一步证实DHAV-1感染激活了ERSR,且不具有细胞特异性。3.DHAV-1感染激活UPR通路的鉴定本研究主要通过Western blot进一步鉴定DHAV-1具体激活的UPR途径。Western blot结果显示DHAV-1感染使磷酸化的蛋白激酶样ER激酶(Protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)及磷酸化的真核启动因子(eukaryotic initiation factor-2α,eIF2α)表达水平增高,而其总蛋白表达量几乎没有变化。进一步研究显示DHAV-1感染能够诱导下游的激活转录因子ATF4、ATF3、促凋亡蛋白CHOP及下游靶蛋白生长停滞和DNA损伤诱导蛋白(growth arrest and DNA damage-inducible protein,GADD34)的上调表达。以上结果说明了DHAV-1感染激活PERK途径。Western blot结果显示DHAV-1感染促进IRE1发生磷酸化,并且RT-PCR结果显示DHAV-1感染后IRE1的底物X盒结合蛋白1(X-box binding protein-1,Xbp1)mRNA发生剪切,说明了DHAV-1感染可以激活IRE1途径。通过Western blot及RT-qPCR对ATF6途径进行分析,结果显示DHAV-1感染不诱导ATF6的剪切,也未诱导其伴侣分子Calnexin和Calreticulin的表达,说明DHAV-1感染不激活ATF6途径。以上结果说明DHAV-1感染激活UPR通路中的PERK与IRE1途径。进一步的Western blot结果表明DHAV-1的结构蛋白VP0、VP1、VP3及非结构蛋白2A2、3C均能诱导ERS标志蛋白GRP78的表达,说明结构蛋白与非结构蛋白共同参与DHAV-1诱导的ERSR。4.DHAV-1感染诱导ERS介导的自噬为了探究DHAV-1感染是否引起自噬,本研究首先通过透射电镜观察自噬体的超微结构,结果显示在经雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)处理的阳性组及DHAV-1感染组的细胞中均能观察到双膜自噬样囊泡的形成,而空白组中没有发现;进一步Western blot检测结果显示DHAV-1感染促进了自噬标记分子微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3-I)向LC3-II的转化。上述结果均表明DHAV-1感染能够诱导细胞自噬的发生。Western blot结果显示,经ERS抑制剂4-苯基丁酸酯(4 phenylbutyrate,4-PBA)处理细胞后,DHAV-1感染引起的LC3-II的转化率显著降低,表明DHAV-1感染可以激活ERS介导的细胞自噬,即ERS在自噬的启动中起重要作用。为了进一步研究ERS和自噬对DHAV-1复制的影响,分别设立衣霉素(Tunicamycin,Tm)、RAPA、4-PBA处理组与DHAV-1单独感染和阴性组,利用RT-qPCR方法检测DHAV-1 mRNA拷贝数,结果显示ERS和及其介导的自噬能够促进DHAV-1的增殖。5.DHAV-1感染诱导ERS介导的细胞凋亡本研究通过免疫荧光及DNA Ladder检测DHAV-1感染DEF后细胞核的变化情况。结果显示DHAV-1感染后细胞核出现明显的固缩和断裂现象,说明DHAV-1感染能够引起细胞凋亡。Western blot结果显示DHAV-1感染能够诱导凋亡执行分子Cleaved-caspase3的剪切表达,并且表达趋势与CHOP表达一致。经4-PBA处理后,CHOP及Cleaved-caspase 3的表达量均降低。由于PERK-eIF2α-ATF4-CHOP途径在ERS引起的凋亡中起决定性作用,且RNA依赖性蛋白激酶R(double-stranded-RNA-activated protein kinase,PKR)蛋白也能促进eIF2α的磷酸化。本研究分别通过ERS诱导剂Tm、ERS抑制剂4-PBA、PERK抑制剂GSK2606414及PKR抑制剂2-AP处理DEF细胞,研究其在DHAV-1引起凋亡过程的调控作用。流式细胞分析结果显示,ERS促进DHAV-1感染诱导的细胞凋亡,抑制ERS、PERK/PKR-eIF2α-ATF4途径均抑制了DHAV-1感染诱导的细胞凋亡率。进一步Western blot与RT-qPCR结果显示抑制PERK/PKR-eIF2α-ATF4途径抑制CHOP的表达上调,且抑制了DHAV-1复制。上述结果表明DHAV-1感染能够激活ERS介导的细胞凋亡,且PERK/PKR-eIF2α-ATF4途径在病毒感染过程中发挥作用。