研究背景肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC),简称为肾癌,占肾脏恶性肿瘤的80%～90%,是泌尿系统常见肿瘤之一,约占成人恶性肿瘤的2%～3%,全球每年新发病例大概有210000。在泌尿系所有的肿瘤中,肾癌危害最大,流行病学资料显示,超过40%的肾癌患者死于该病,全球每年死于肾癌的人数约有100000。外科手术是根治肾癌的主要方法。局限性肾癌患者接受根治性肾切除术或保留肾单位手术后,大约90%以上的患者能够获得5年无病生存。然而约1/3的肾癌患者在初次就诊时就已发现有转移,无法接受根治性手术治疗,另外局限性肾癌患者行根治性手术后仍有大约20%～30%的复发和转移率。转移性肾癌(metastatic renal cell carcinoma, mRCC)的预后非常差,中位生存期只有6～12个月,5年生存率小于10%。因此,转移性肾癌的治疗仍是临床面临的一项重大挑战。肾癌对传统的放化疗均不敏感。基于肾癌的免疫原性,以IFN- a和IL-2为代表的细胞因子和免疫治疗,能够改善部分患者的临床症状,然而不能显著改善患者的无进展生存时间和总生存时间,总体有效率不到20%,并且有严重的副作用,只有少部分患者能够耐受治疗。鉴于此,需要探索mRCC新的治疗手段。以酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼(Sorafenib)为代表的肾癌分子靶向治疗药物的出现,开创了mRCC治疗的新时代。目前临床上肾癌分子靶向治疗药物主要分为两类,VEGF信号通路(血管生成信号通路)抑制剂和mTOR信号通路抑制剂。上述靶向治疗药物能够显著提高患者的无进展生存时间和总生存时间,副作用较免疫治疗轻微。然而其仍然面临许多挑战:首先,治疗有效率仍较低,只有大约10%～40%,与干扰素相比,其生存优势只有6个月;其次,随着治疗的进行,绝大多数患者最后都会发展成对靶向治疗药物产生抗药性;最后,靶向治疗药物花费昂贵,只有极少的一部分患者能够承担并接受这些治疗。因此有必要探索并寻找新的治疗靶点和药物,为mRCC的治疗提供更多的选择。二甲双胍(Metformin)是临床上广泛使用的一种双胍类降糖药物,主要用途是用于治疗2型糖尿病。最近的研究发现,使用二甲双胍的糖尿病患者,其患前列腺癌、乳腺癌、肝癌等肿瘤的风险降低,并且肿瘤相关死亡率也降低。同时实验研究发现,二甲双胍能够抑制体外培养的前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、黑色素瘤细胞的增殖,并且体内实验证实二甲双胍能够抑制上述肿瘤的生长。上述研究提示二甲双胍对肿瘤的防治可能有意义。但目前还没有关于二甲双胍对肾癌生长影响的研究报道。二甲双胍对肾癌细胞的增殖、迁移以及死亡是否有影响,二甲双胍能否抑制肾癌瘤块的生长,目前尚不清楚。此外二甲双胍抑制肿瘤生长的机制也不清楚,是否与其降低血糖、对代谢的影响有关,以及具体通过什么分子机制、信号途径来实现对肿瘤生长的抑制都还需要深入细致的研究。鉴于目前转移性肾癌治疗所面临的困难局面,二甲双胍作为一种廉价、安全的治疗药物,研究其对肾癌生长的可能影响,将是非常有意义的研究工作,其结果将对转移性肾癌的临床治疗起到有意义的借鉴。研究目的本研究将以体外培养的肾癌细胞及肾癌移植瘤为研究模型,通过体外实验及体内实验探讨二甲双胍对肾癌生长的影响,并从分子水平探讨二甲双胍引起上述影响的可能机制。希望通过以上研究,明确二甲双胍对肾癌生长的影响,并且初步探讨其机制,为二甲双胍的抗肿瘤效应提供新的证据,为转移性肾癌的临床治疗提供新的思路和治疗选择。方法一、体外细胞实验:采用MTT法检测不同浓度的二甲双胍对肾癌细胞786-O、OS-RC-2增殖以及生长曲线的影响;检测不同浓度的二甲双胍对786-O、OS-RC-2细胞克隆形成的影响;利用划痕愈合实验来检测二甲双胍对786-O、OS-RC-2细胞迁移能力的影响;采用Annexin V-FITC/PI染色,分别在荧光显微镜下观察及流式细胞仪分析来检测二甲双胍对肾癌细胞死亡的影响。二、体内动物实验:构建肾癌细胞的裸鼠移植瘤模型,检测二甲双胍对肾癌移植瘤生长的影响。三、机制初步探讨:利用流式细胞仪检测分析二甲双胍对肾癌细胞周期进行的影响;利用免疫印迹法及荧光实时定量RT-PCR等技术研究二甲双胍对细胞周期调控蛋白、AMPK信号通路、mTORC1信号通路、mTORC2信号通路及肿瘤侵袭相关基因的影响,探讨二甲双胍抑制肾癌细胞生长、迁移及促进其死亡的分子机制。结果一、二甲双胍能够抑制体外培养的肾癌细胞增殖MTT结果显示二甲双胍能够抑制786-O和OS-RC-2细胞增殖,且具有浓度依赖性和时间依赖性,二甲双胍抑制其增殖的最小作用浓度分别是0.2 mM和0.5 mM。二、二甲双胍能够抑制肾癌细胞克隆形成二甲双胍同样能够抑制786-O和OS-RC-2的克隆形成,表现出浓度依赖性,5mM的二甲双胍作用时,786-O和OS-RC-2的克隆形成比率仅为22.2%和14.4%三、二甲双胍降低肾癌细胞迁移能力细胞划痕实验发现,二甲双胍能够降低786-O和OS-RC-2的细胞迁移指数。四、二甲双胍能够诱导肾癌细胞在低浓度血清环境死亡通过Annexin V-FITC/PI染色的荧光显微镜观察及流式细胞仪检查发现,二甲双胍对正常血清浓度培养的786-O细胞的死亡无影响,但能诱导其在低浓度血清环境死亡,5mM二甲双胍处理组死亡细胞比例为15%,较对照组6%明显上升。五、二甲双胍能够抑制肾癌移植瘤的生长786-O细胞接种于裸鼠皮下以形成瘤块,构建肾癌裸鼠移植瘤模型。二甲双胍给药裸鼠其皮下肿瘤生长速度减缓,14 d后,其瘤块体积较对照组明显缩小。六、二甲双胍抑制肾癌细胞周期进行流式细胞仪检测发现二甲双胍能够抑制肾癌细胞从G0/G1期进入S期、阻止其细胞周期的进行;免疫印迹检测提示二甲双胍导致肾癌细胞中Cyclin D1表达量的降低,同时二甲双胍处理的裸鼠移植瘤中Cyclin D1表达量也降低。说明二甲双胍抑制肾癌细胞增殖与肾癌移植瘤生长的主要机制可能是通过下调Cyclin D1表达、阻止细胞从G0/G1期进入S期从而阻止细胞周期的进行来实现。七、二甲双胍激活肾癌细胞中AMPK信号通路免疫印迹检测发现二甲双胍能够增加肾癌细胞中AMPK磷酸化水平,即能够激活AMPK信号通路;八、二甲双胍抑制肾癌细胞中mTORC1和mTORC2信号通路二甲双胍使肾癌细胞中mTORC1的下游分子S6K1 (Thr389)和、4E-BP1 (Thr 37/46)及S6(Ser235/236)均发生去磷酸化,并表现出时间依赖性,说明二甲双胍抑制肾癌细胞中mTORC1信号通路;二甲双胍使肾癌细胞中mTORC2的下游分子Akt去磷酸化,说明二甲双胍抑制肾癌细胞中mTORC2信号通路。九、二甲双胍下调肾癌细胞中MMP-7和uPA表达水平实时荧光定量RT-PCR检测发现,二甲双胍降低肾癌细胞中MMP-7和uPA的mRNA表达水平。结论本研究首次报道发现二甲双胍对肾癌生长的抑制作用:体外细胞实验证实二甲双胍能够抑制肾癌细胞增殖,降低其迁移能力并诱导其在低浓度血清环境下死亡;体内动物实验发现二甲双胍能够抑制肾癌裸鼠移植瘤的生长,从整体水平证实了二甲双胍对肾癌生长的抑制作用。通过分子水平的研究,我们认为二甲双胍抑制肾癌生长的主要机制包括:二甲双胍通过下调肾癌细胞中Cyclin D1表达,抑制肾癌细胞G0/G1期进入S期从而阻止细胞周期的进行,是二甲双胍抑制肾癌细胞增殖、移植瘤生长的主要机制;二甲双胍抑制肾癌生长的机制还与其激活AMPK信号通路、抑制mTORC1及mTORC2信号通路有关;二甲双胍降低肾癌细胞的迁移能力与其下调MMP7与uPA的表达水平有关。我们的研究结果表明二甲双胍具有潜在治疗肾癌的作用,将有可能成为转移性肾癌治疗的有潜力药物选择,这为二甲双胍的抗肿瘤效应提供了新的证据,为转移性肾癌的临床治疗提供新的思路和治疗选择。