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目的构建H3(B7H3的简称)嵌合型抗原受体T细胞,探究其对MDA-MB-231细胞的杀伤效果以及探讨靶向人类H3肿瘤表面抗原的嵌合型抗原受体T细胞在三阴性乳腺癌治疗中的可行性与有效性。方法1三阴性乳腺癌与非三阴性乳腺癌组织H3蛋白表达的检测1)收集我院三阴性乳腺癌患者78例及非三阴性乳腺癌患者54例2)通过免疫组织化学染色法检测两组病人乳腺肿瘤组织中H3蛋白的表达情况。2 H3-CAR表达质粒的构建1)PLVX-CD19-CD137-CD3质粒与PCDH-EF1-H3scFV质粒双酶切(XbaI/SgrA-I)获得线性载体(含有-CD137-CD3的载体)及目的片段(H3 scFV)。2)通过T4连接酶将目的片段(H3 scFV)及线性载体(含有-CD137-CD3的载体)连接起来,获得H3 CAR表达质粒。3 H3 CAR慢病毒载体的包装、浓缩、滴度测定以及三阴性乳腺癌细胞H3蛋白表达的检测1)磷酸钙法将H3 CAR表达质粒和两个包装质粒(pSPAX2、pMD2.G质粒)转染至293FT细胞(人胚肾细胞)。2)收集48小时和72小时的细胞上清,离心去除细胞碎片后使用超速离心机浓缩病毒,用1640培养基溶解病毒沉淀,分装,液氮速冻后置于-80℃冰箱保存。3)倍比稀释病毒浓缩液后感染293FT细胞,48h后用流式细胞术检测H3阳性细胞百分比,计算病毒生物滴度。4)培养三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-231 H3KO,分别取2.5×10~5个生长状态良好的细胞,用流式细胞术检测细胞表面H3蛋白的表达水平。4慢病毒感染PBMCs1)分离健康人外周血单核细胞(PMBCs),CD3/CD28磁珠刺激T细胞活化、增殖。2)刺激48h后,用H3 CAR慢病毒(MOI=20)感染PBMCs。感染96h后,用流式细胞术检测H3 CAR的表达率以及CAR T细胞表型。5 CAR T细胞靶向杀伤MDA-MB-231细胞功能检测1)H3 CAR T细胞和未感染病毒的T细胞分别与MDA-MB-231细胞及MDA-MB-231 H3KO细胞共培养,对比两者对MDA-MB-231细胞及MDA-MB-231-H3KO细胞的杀伤效果。2)H3 CAR T细胞和未感染病毒的T细胞分别与MDA-MB-231细胞及MDA-MB-231 H3KO细胞共培养,对比IL-2、TNF以及INF-γ的释放量。3)H3 CAR T细胞和未感染病毒的T细胞分别与MDA-MB-231细胞及MDA-MB-231 H3KO细胞共培养,通过胞内染色再次对比IL-2和INF-γ的释放量。结果1.三阴性乳腺癌与非三阴性乳腺癌组织H3蛋白表达的检测三阴性与非三阴性乳腺癌中H3表达阳性的患者所占比例分别为:67%、30%。H3蛋白在三阴性与非三阴性乳腺癌中表达有显著性差异(p<0.001)。2.H3 CAR表达质粒的构建以及H3 CAR慢病毒滴度的测定1)酶切、连接成功后挑取单克隆,小提质粒后跑胶鉴定,挑取序列大小正确的单克隆的质粒进行DNA测序,测序结果正确。2)H3 CAR慢病毒滴度为1.5×10~8 TU/ml。3.CAR T细胞制备和表型检测1)H3 CAR慢病毒感染T细胞后H3 CAR表达率为63.4%。2)CAR T细胞表型检测:单阳结果为:CD3~+T细胞占96.2%,CD4~+T细胞占33.89%,CD8~+T细胞占56.6%,CAR T细胞占64.6%?双阳结果:CAR~+CD3~+T细胞占64.6%,CAR~+CD4~+T细胞占27%,CAR~+CD8~+T细胞占39.6%。?CAR T细胞主要由CD3~+CD8~+的T细胞构成。4.CAR T细胞靶向杀伤MDA-MB-231细胞功能检测1)体外杀伤试验显示H3 CAR T细胞对MDA-MB-231细胞的杀伤作用与c-ontrol T细胞相比有显著性差异(p<0.001)且H3 CAR T细胞对MDA-MB-23-1和MDA-MB-231 H3KO细胞的杀伤作用相比有明显差异(p<0.001)。2)H3 CAR T细胞和control T细胞分别与MDA-MB-231及MDA-MB-231-H3KO共培养后,与MDA-MB-231细胞共培养的CAR T细胞比control T细胞分泌更多的IL-2和IFN-γ,因此两者分泌的细胞因子量有显著性差异(p<0.001)。与MDA-MB-231共培养的CAR T细胞比与MDA-MB-231 H3KO共培养的CA-R T分泌更多的IL-2和IFN-γ,因此两者两者分泌的细胞因子量有显著性差异(p<0.001)。结论1.成功制备了H3 CAR T细胞,且H3 CAR分子在T细胞上表达良好。2.H3 CAR T细胞在体外可以靶向识别并特异性杀伤H3~+的MDA-MB-231细胞。3.H3 CAR T细胞对肿瘤细胞的杀伤依赖于CAR T细胞的数量以及肿瘤细胞H3的表达水平。4.本研究为H3 CAR T细胞临床治疗三阴性乳腺癌提供了理论与实验依据。