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目的:应用实时荧光定量RT-PCR的方法,检测哮喘大鼠肺组织中的CKLF1 mRNA定量表达情况,探讨哮喘大鼠肺组织是否有CKLF1 mRNA的高表达,从基因水平探讨支气管哮喘的发病机制。
方法:30只成年健康雄性SD大鼠,根据随机化分配的原则,将30只大鼠按体重编号,采用随机排列表法分为哮喘组及对照组(N组);再根据哮喘激发时间(1、3、7、14天)将哮喘组又分为A、B、C、D四组,以卵蛋白(OVA)作为过敏原、氢氧化铝为佐剂致敏SD大鼠14天后,雾化吸入1%OVA激发制备哮喘大鼠模型。到末次激发后24h处死大鼠,作肺泡灌洗液后细胞计数、分类计数;并观察肺组织病理变化。同时取右肺中叶组织提取总RNA,再用紫外分光光度计测定OD260与OD280的分光光度值,计算出各组RNA的浓度与纯度,并用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA分子的完整性,然后用统计学方法检测各组之间的RNA浓度与纯度的差异。利用实时荧光定量RT-PCR技术把CKLF1基因逆转录成cDNA,然后在实时荧光定量PCR仪上进行体外扩增,获得各个样本循环指数增长期的起始点即Ct值,以Ct值来计算其起始cDNA模板的相对拷贝数,以GAPDH基因作为内参照物进行校正,以校正的相对拷贝数用单因素方差分析进行检验,并分析各组之间的差异。
结论:CKLF1基因在哮喘大鼠动物模型中表达明显升高,并呈动态变化,7天达峰值;提示CKLF1可能参与哮喘的病理生理过程。