目的:银屑病是一种复发率较高难以根治的慢性皮肤病,目前临床上尚无理想的治疗药物。芍苓汤是我院名老中医榻国维教授治疗银屑病验方基础上优化而来的方剂,为考察其药用价值,本文从药效、毒性、机制方面进行了研究,为其开发了奠定了基础。方法:1芍苓汤药效实验1.1小鼠鼠尾鳞片实验,昆明种小鼠分为生理盐水组和芍苓汤低、中、高剂量组共4个组。每组15只,雌雄各半。给药15天后从尾根部向尾尖方向取1.8cm皮肤一条,做组织病理切片,计数CK10阳性颗粒细胞层存在的鳞片数目占总鳞片总数的百分比。1.2雌鼠阴道上皮细胞有丝分裂实验,昆明种小鼠分为空白组、模型组、芍苓汤高、中、低剂量组,银屑灵优化方组。每组雌鼠10只。连续3d注射己烯雌酚造模后给药6天,给药结束后取阴道组织做组织病理切片,计算阴道组织基底细胞有丝分裂数。1.3二甲苯致小鼠耳肿胀实验:小鼠分为空白组、芍苓汤高、中、低剂量组,银屑灵优化方组,每组雄鼠10只。给药10天后,用二甲苯制造耳肿胀模型,以左右耳互为对照计算耳片重量得到肿胀度,比较各组小鼠的耳肿胀度。1.4心得安豚鼠实验:分为空白组、模型组、芍苓汤高、低剂量组,银屑灵优化方水工艺提取物高、低剂量组,阳性对照药甲氨蝶呤组。每组豚鼠10只;除空白组外以心得安乳剂涂抹各组豚鼠耳部,连续5天制造银屑病皮损模型后给药10天,给药结束后取豚鼠耳部制作组织病理切片。观察病理切片显微形态并进行Baker评分。1.5 HaCaT细胞增殖抑制实验:用噻唑蓝(MTT)检测芍苓汤、银屑灵优化方水工艺提取物给药后HaCaT细胞的活力;用OD值表示细胞活力,比较各组细胞活力值大小。2毒性研究SPF级昆明种小鼠,19～20g。分为空白组和芍苓汤组,雌雄各半,每组10只。芍冬汤以临床79倍剂量灌胃给药,一天内共给药两次,间隔4h。观察小鼠外观、精神、有无毒性反应,计算小鼠死亡率,解剖死亡小鼠,观察脏器状态。3芍苓汤有效部位(成分)研究3.1芍苓汤不同部位的分离:用乙酸乙酯萃取芍苓汤得到乙酸乙酯部位,萃取水层用HD20大孔树脂分离得到水、50%乙醇、95%乙醇三个部位。3.2芍苓汤不同部位药效考察:豚鼠分为空白组、模型组、芍苓汤水部位、50%醇部位、乙酸乙酯部位、95%醇部位组、阳性对照药甲氨蝶呤组。每组5～8只。用心得安乳剂涂抹豚鼠耳部造模5天,给药10天,给药结束后取耳部皮肤制做组织病理切片,观察其显微形态并进行Baker评分。3.3液相-质谱联用(LC-MS)分析芍苓汤不同分离部位的成分。3.4 MTT法检测芍苓汤中单体成分芍药苷、落新妇苷、隐绿原酸、新绿原酸、黄杞苷、迷迭香酸对HaCaT细胞的活力影响。4芍苓汤药效机制研究4.1实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-Time RT-PCR)检测芍苓汤、芍药苷、落新妇苷对LPS诱导HaCaT细胞IL-6、IL-17A、IL-22mRNA表达的影响。4.2酶联免疫吸附法(ELISA)检测芍苓汤、芍药苷、落新妇苷对LPS诱导HaCaT细胞IL-6、IL-17A、IL-22这三个因子表达的影响。4.3 蛋白质印迹法(Western blot)检测 LPS 对 HaCaT 细胞 P38、ERK1/2、ERK1/2磷酸化蛋白的表达,研究芍苓汤、芍药苷、落新妇苷对LPS诱导这三个蛋白表达的影响。结果:1药效实验1.1小鼠鼠尾鳞片实验:芍苓汤能增加小鼠CK10阳性颗粒细胞鳞片在总鳞片数中的比例,高、中、低剂量组相比空白组均有显著性差异。1.2雌鼠阴道上皮细胞有丝分裂实验:芍苓汤能减少雌鼠阴道上皮基底层细胞有丝分裂数,中、高剂量与模型组相比有显著性差异。1.3二甲苯致小鼠耳肿胀实验:芍苓汤能减轻小鼠耳肿胀度,中剂量组相比空白组有显著性差异。1.4心得安豚鼠模型:与空白组相比,模型组明显表现出银屑病样皮损,Baker评分显著提高;与模型组相比,芍苓汤高、低剂量均能显著改善心得安豚鼠皮损的严重程度,降低Baker评分,Baker评分数与阳性药甲氨蝶呤相比无显著性差异。1.5 HaCaT细胞增殖抑实验:相比空白对照组,浓度15.6～250μg/mL的芍苓汤对HaCaT细胞均有显著的抑制作用,62.5 μg/mL抑制作用最强,以该浓度为峰值,量效关系呈倒抛物线型曲线。2芍苓汤急性毒性评估芍苓汤给药剂量达到临床158倍时,小鼠尚无死亡。给药后3到5只小鼠有活动减少、喘息急促等不良反应出现,但较快恢复正常。3芍苓汤有效部位(成分)研究芍苓汤水部位、50%乙醇部位和乙酸乙酯部位均能显著降低心得安豚鼠病理组织的Baker评分。其中,水部位对表皮的角化异常改善效果较好;乙酸乙酯部位能减轻真皮层的炎性细胞浸润;50%乙醇部位能够同时改善表皮角化异常、炎细胞浸润和真皮血管扩增;通过LC-MS分析显示,芍苓汤中含有芍药苷、落新妇苷、新绿原酸、隐绿原酸、黄杞苷、迷迭香酸。HaCaT细胞增殖抑制实验显示:芍药苷浓度6.24～104.07μ mol/L和落新妇苷浓度6.66～222.02 μ mol/L对HaCaT细胞增殖有抑制趋势;黄杞苷浓度6.91～230.21 μ mol/L以剂量依赖方式对HaCaT细胞有促进增殖作用,70.56和282.24μ mol/L隐绿原酸及新绿原酸有抑制HaCaT细胞增殖活性。34.69～277.52μ mol/L迷迭香酸对HaCaT细胞增殖有抑制作用,浓度越低抑制效果越强。4芍苓汤、芍药苷和落新妇苷的作用机制研究在LPS刺激HaCaT细胞炎性模型上,芍苓汤对IL-6mRNA和蛋白的表达均以剂量依赖方式显示抑制作用,对IL-17A的mRNA表达有抑制趋势,蛋白表达有促进趋势,对IL-22的mRNA和蛋白表达均有抑制趋势。芍苓汤的主要成分芍药苷和落新妇苷对IL-6、IL-17、IL-22mRNA的表达有显著地抑制作用。芍药苷对IL-6蛋白表达有下调趋势,对IL-22蛋白表达有显著抑制作用;落新妇苷对这两种因子的蛋白表达均有显著抑制作用。芍药苷、落新妇苷对IL-17A蛋白表达均有促进趋势。5芍苓汤、芍药苷和落新妇苷均有抑制LPS刺激引起的P38蛋白水平的升高的作用,对ERK1/2和ERK1/2磷酸化蛋白表达有抑制趋势。结论:1芍苓汤在鼠尾鳞片模型、雌鼠阴道上皮细胞膜型、二甲苯致小鼠耳肿胀模型、心得安豚鼠模型上均有显著的改善作用,对HaCaT细胞增殖有抑制作用。芍苓汤给药剂量达临床158倍,尚无急性毒性,结合药效结果说明芍苓汤安全有效,具有开发为银屑病临床治疗新药的价值。2芍苓汤的三个有效部位分别为水部位、乙酸乙酯部位、50%乙醇部位,前两者分别从缓解表皮角化异常和减轻炎症浸润改善心得安豚鼠的病变,后者除了有前者的药效还有改善微血管扩张的作用。提示芍苓汤可能作用多个银屑病病变的环节,不同分离部位可能侧重不同的病理环节。3芍苓汤中的成分迷迭香酸、新绿原酸、隐绿原酸是HaCaT细胞增殖抑制的活性成分,芍药苷、落新妇苷对HaCaT细胞增殖有抑制的趋势,黄杞苷对HaCaT细胞的增殖有促进作用,这三个成分可能在其他环节上发挥治疗银屑病的药效。4芍苓汤及其主要成分芍药苷、落新妇苷能够通过调节IL-6、IL-22的mRNA和蛋白水平发挥抗炎作用。P38MAPK可能是其作用的信号通路。