角膜缘干细胞位于角膜缘基底层，是角膜上皮细胞分化和增殖的来源。眼部化学伤、热烧伤、Stevens-Johnson综合征(Stevens-Johnsonsyndrome，SJS)等多种病因可引起角膜缘干细胞缺乏(limbalstemcelldeficiency,LSCD)，临床表现以角膜结膜化、新生血管、基质瘢痕化等为特征，最终导致角膜混浊、溃疡、穿孔，甚至视力丧失。对于此类由角膜缘干细胞缺乏导致的严重眼表疾病(ocularsurfacedisease，OSD)，眼表重建(ocularsurfacereconstruction，OSR)为首选的治疗，但常规手术方法疗效欠佳。结膜移植术后出现大量角膜基质新生血管，且结膜组织透明度低，影响患者视力及外观。羊膜移植术后眼表上皮为结膜表型，且对于严重干眼、弥漫性上皮角化和角膜缘缺血等患者疗效甚微。自体角膜上皮移植(角膜上皮移植术和角膜缘移植术)仅能治疗单眼发病患者，异体角膜缘干细胞移植术后存在排斥反应，影响植片长期存活。随着生物工程及再生医学的发展，人们尝试使用体外培养非角膜上皮来源的复层非角化上皮细胞移植片自体移植进行眼表重建。本课题目的在于制备兔角膜缘干细胞衰竭模型，观察以脱细胞羊膜为载体体外培养的人口腔粘膜上皮移植片用于眼表重建的疗效及可行性，为人口腔粘膜自体移植提供理论和实验依据。 第一章：目的1.探索体外培养人口腔粘膜上皮细胞的方法。2.体外培养人口腔粘膜上皮细胞的鉴定。方法取供体口腔颊部粘膜上皮组织制备成单细胞悬液，以脱细胞羊膜为载体、3T3成纤维细胞为饲养层，采用气—液相培养方法构建移植片。培养后期对口腔粘膜上皮细胞移植片进行形态学观察及免疫组化染色以鉴定移植片上皮细胞的表型。结果以羊膜为载体体外培养的人口腔粘膜上皮细胞为排列整齐的复层上皮，细胞结构完整，组织学上类似正常人角膜上皮。免疫组化结果显示，正常及体外培养的人口腔粘膜上皮均表达角蛋白K3、K4、K13，角蛋白K10表达阴性。结论1.人口腔粘膜上皮为复层非角化上皮细胞，生物学特性与正常人角膜上皮相似，且分化程度低、更新周期短，可作为角膜上皮移植替代物。2.脱细胞羊膜结构稳定、抗原性低，可作为体外培养人口腔粘膜上皮细胞的良好载体。3.采用3T3成纤维细胞为饲养层，气—液相体外培养人口腔粘膜上皮，细胞复层排列整齐，可分化为角膜样上皮细胞。4.体外培养的人口腔粘膜上皮细胞与脱细胞羊膜贴附紧密，构建的口腔粘膜上皮移植片结构稳定。 第二章：目的1.探讨使用体外培养人口腔粘膜上皮移植重建眼表的方法。2.评价体外培养口腔粘膜上皮移植在眼表重建中的价值。方法采用环形板层切除法制备单眼兔角膜缘干细胞衰竭模型，3-4周后行口腔粘膜上皮片移植术重建眼表。术中刮除兔角膜面增生的结膜化组织及新生血管膜，将体外构建的人口腔粘膜上皮移植片平铺于角膜创面，角膜缘处缝线间断缝合。术后每日行裂隙灯检查，观察移植片的存活状况及眼表的稳定性。术后1月取兔角膜组织进行组织学切片和免疫组化染色明确上皮来源。结果制备角膜缘干细胞衰竭模型术后，1只兔因术眼感染自然死亡；余9只兔术眼出现角膜结膜化、新生血管及角膜混浊等角膜缘干细胞缺乏表现。7只兔行眼表重建术后，6只兔植片存活情况良好，1％荧光素钠染色阴性，角膜透明度较术前不同程度提高，移植片下方见新生血管增殖，局限于角膜周边区；1只白兔因术后3天羊膜脱落更换移植片，二次术后植片存活良好，角膜透明程度提高。术后1月角膜HE染色见复层上皮细胞排列紧密，免疫组化结果角蛋白K3、K4、K13表达阳性。结论1.体外培养的人口腔粘膜上皮移植重建兔眼表后，移植片上皮细胞排列与正常人角膜上皮类似，免疫组化染色证实为人口腔粘膜上皮来源，而非兔结膜上皮来源。2.体外培养的人口腔粘膜上皮移植术后，移植片存活情况良好、眼表结构稳定。 综上所述，以脱细胞羊膜为载体体外培养的人口腔粘膜上皮具有分化为角膜样上皮细胞的特性，可成功用于兔角膜缘干细胞衰竭模型的眼表重建。通过进一步观察该手术长期效果以评价其疗效，使之成为治疗严重眼表疾病的新型、安全、有效方法。