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研究背景：
关节软骨损伤退变是骨科临床上尚未完全解决的难题，老年人以软骨退变为主，年轻人则以运动创伤引起的软骨损伤为首要原因，晚期发展为骨关节炎(osteoarthritis，OA)，可引起疼痛和病残，导致生活质量降低、医疗费用增加等问题。关节软骨自身修复能力十分有限，临床上的自身修复多以纤维软骨组织的形式来填补缺损，采用自体组织或同种异体组织如自体骨软骨复合物、软骨细胞、软骨膜等修复软骨缺损，对缓解疼痛、恢复关节功能具有一定的疗效，但关节软骨来源有限、供区周围软骨退变，修复区软骨退变、免疫排斥反应等，都可使临床远期疗效并不理想。组织工程软骨为关节软骨缺损的修复带来了希望，成为关节外科的研究热点，但软骨损伤修复的机制仍不是很清楚，作为种子细胞的干细胞定向成软骨细胞分化的效果与体内正常的软骨细胞仍然有一定差异，而干细胞的来源有很多，如骨髓、脂肪、血液等，其中以骨髓间充质干细胞(bone marrow derived stem cells，BMSCs)最能模拟体内软骨损伤自我修复的过程。现有很多促使干胞细胞分化为软骨细胞的方法，但仍需进一步改善，因此一定程度上阻碍了组织工程软骨的应用，因此了解干细胞，尤其是BMSCs定向成软骨细胞分化的调控机理则显得尤为重要。
已有报道指出 microRNAs在胚胎软骨发育过程中表达有时间特异性，其对干细胞的增殖、分化起着重要作用，有可能参与调控软骨组织的发育、成熟及生物学特性的维持。MicroRNAs(miRNAs，miR)是一类长度约～22个核苷酸肽的非编码RNAs，在转录后染色体中发挥阻遏基因表达的功能[1，2]，主要是通过和靶mRNA序列碱基互补配对，导致靶mRNAs的裂解或抑制它们有效翻译。在生物机体发育的不同阶段，miRNAs广泛参与机体生理、病理过程[3]，例如胚胎发育，细胞增殖、分化、凋亡等。在不同的动物中，约1～3％的基因为miRNAs[4]，约1/3的人类基因潜在的受miRNAs调控，且每个miRNA的平均靶基因大于200个[5]，英具有多基因调控的功能，在复杂的细胞信号网络中发挥着关键的作用，尤其是功能蛋白表达的控制方面，因此特殊的miRNAs将可能是调控BMSCs定向分化为软骨细胞的关键因子。本课题在体外诱导BMSCs定向成软骨细胞分化过程中检测miRNAs(共10个：miR-140、miR-196b、miR—346、miR—302a、miR—302b、miR—367、miR-134、miR—290、miR—296、miR—34b)的表达情况，寻找差异性表达的miRNAs，试图藉此诱导BMCSs分化为软骨细胞或改善其分化为软骨细胞的能力和/或功能，同时寻找其相应的靶基因，将可能对软骨再生医学产生积极的科学意义。
目的：
1.研究胎儿和SD大鼠BMSCs体外定向成软骨细胞分化过程中miRNAs的
变化。
2.预测表达有统计学差异的miRNAs的靶基因。
3.综述miRNAs在软骨领域的研究进展。
方法：
1.采用梯度密度离心法获取胎儿和SD大鼠的BMSCs，体外扩增培养，并通过观察形态学，描绘生长曲线和计算倍增时间等方法了解其体外扩增生长的特性，及成软骨诱导液对其生长扩增能力影响的研究。
2.运用成骨细胞诱导液和成脂肪细胞诱导液，分别在体外对BMSCs进行成骨细胞诱导和成脂肪细胞诱导，分别通过钙结节染色和油红O染色证实其具有体外多向分化的功能。
3.运用细胞团培养体系体外诱导BMSCs定向成软骨细胞分化，分为2组：BMSCs细胞团+完全培养液；BMSCs细胞团+成软骨细胞诱导液，培养3个星期，分别在1w、2w、3w时间点收取细胞团块，RNA标本置于—80℃冰箱和组织学检测标本进行石蜡包埋切片。采用Alcian blue和Safranin O组织学染色方法，及几型胶原免疫组化染色方法，对诱导后的BMSCs细胞团块进行成软骨鉴定。
4.收集所有诱导后的BMSCs细胞团块标本，提取RNA进行实时定量RT—PCR检测BMSCs定向成软骨细胞分化过程中10个感兴趣miRNAs(miR-140、miR-196b、miR—346、miR—302a、miR—302b、miR—367、miR-134、miR—290、miR—296、miR—34b)的表达情况。
5.统计分析实验数据，获得差异性表达的miRNAs，通过miRNAs数据库预测相应的靶基因。
6.检索国内外文献，综述miRNAs在软骨领域的研究进展。
结果：
1.胎儿和SD大鼠的BMSCs体外扩增良好，形态学稳定，胎儿BMSCs倍增时间与SD大鼠BMSCs倍增时间相似，细胞体积和核均较大，成软骨细胞诱导液促进BMSCs分化能力，减弱其增殖能力。
2.BMSCs在体外经过3w成骨细胞诱导，钙结节染色呈阳性反应；经过3w成脂肪细胞诱导，细胞内脂滴油红染色呈阳性反应；经过体外细胞团块培养3w成软骨细胞，组织学切片Alcian blue和Safranin O软骨基质染色成阳性反应，证实获取的BMSCs具有体外多向分化的功能。
3.BMSCs细胞团分别经完全培养液和成软骨细胞诱导液培养3w后，成软骨细胞诱导液组缨胞团的Alcian blue和Safranin O染色呈阳性反应，同时п型胶原免疫组化染色也呈阳性反应，而完全培养液组细胞团块相应的常规组织学染色和免疫组化染色呈阴性反应。
4.miRNAs的实时定量RT—PCR检测结果提示，与对照组比，成软骨细胞诱导组的miR-140、miR—296、miR-196b、miR—346、miR—302a和miR—302b的表达量增加有显著差异性，miR-134在胎儿标本中表达增加，而在SD大鼠标本中表达降低，显示其表达的组织特异性，而miR—367和miR—34b在两组的表达差异不明显，miR—290在sD大鼠诱导的和没有诱导的BMSCs中均不表达。
5.透过miRNAs数据库预测相应的靶基因，hsa—miR-196b对应同源盒蛋白(Homeobox protein Hox—B8)，hsa—miR—302a/b/367对应酪氨酸蛋白激酶(Tyrosine—protein kinase JAK1)，rno—miR—346对应核转录因子1(Nucleolar transcription factor1)，mmu—miR-140对应聚合酶5(polymerase，epsilon)，mmu—miR-134对应解聚素和金属肽酶域33(a disintegrin and metallopeptidase domain33，ADMD33)，rno—miR—346对应Col2A1，TGF—β1/3，IGF-1，mmu—miR—34b对应ADAMTS4/5，以上靶基因主要涉及软骨发育、软骨退变、细胞周期和炎症信号通路等，需要进一步进行验证和探索。
结论：
成功在体外培养胎儿和sD大鼠的BMSCs，且它们均具有多向分化的功能。BMSCs在体外定向成软骨细胞分化过程中，miR-140、miR—296、miR-196b、miR—346、miR—302a和miR—302b的表达量增加有显著差异性，miR-134在胎儿标本中表达增加，而在SD大鼠标本中表达降低，显示了其组织特异性，而miR—367和miR—34b在两组的表达差异不明显，miR—290在sD大鼠诱导的和没有诱导的BMSCs均不表达。通过数据库预测相应的靶基因，有利于进一步研究差异性miRNAs在BMSCs定向成软骨细胞分化的功能，同时也可能是软骨再生医学研究的新领域和有助于阐释软骨疾病的发病机理，获得良好的科学和临床价值。