乳品产业的迅速发展及人们生活水平的不断进步,使乳制品消费市场不断扩大,怎么进一步提升乳产量和优化乳品质已经成为了当今奶业研究的重点。微小RNA(mi RNA)是一类重要的转录后调控的非编码小RNA分子。在动物中,mi RNA与其靶基因的3’UTR区互补结合时抑制其翻译或特异性切割靶mRNA使其降解从而调控基因的表达。mi RNA在个体发育、细胞增殖、凋亡、分化中发挥重要作用,不少研究表明mi RNA在哺乳动物乳腺发育和泌乳中具有重要调控功能。表观遗传作为目前生命科学领域研究的热点,已有研究证明它在乳蛋白基因的表达及动物乳腺发育和重塑的过程中具有重要的调控作用。DNA甲基化作为主要的表观遗传修饰方式之一,在DNA甲基化转移酶(DNMT)的作用下,Cp G二核苷酸的胞嘧啶环5’位的氢被S-腺苷甲硫氨酸的活性甲基所取代变成5’-甲基胞嘧啶,通过这种作用机制在不改变DNA碱基序列的情况下调控基因在组织和细胞中的表达。在哺乳动物中,DNA甲基转移酶主要包括DNMT1、DNMT3A和DNMT3B,其中DNMT3A和DNMT3B具有从头甲基化活性,不需要母链的指导,可在未甲基化的DNA双链上进行甲基化,在基因组DNA甲基化异常的发生中具有重要的引导作用。DNA甲基化参与许多重要生理及病理现象的调控,有研究表明在奶牛乳腺中DNA甲基化与乳蛋白基因的表达调节密切相关,这就为乳腺发育、泌乳功能机理研究提供了新的方向。mi RNA对DNA甲基化模式的调控多数集中在肿瘤等疾病的研究上,在奶牛乳腺中还鲜见报道。本课题组前期研究发现mi RNA在高、低乳品质奶牛乳腺组织中的表达具有显著差异,在高乳品质奶牛乳腺组织中上调的mi RNAs中,mi R-29s家族(mi R-29a、mi R-29b、mir-29c)与在DNA甲基化中起关键作用的DNA甲基化酶DNMT3A和DNMT3B的3’UTR有互补序列,mi R-29s是否能通过调控制DNA的甲基化进而影响奶牛乳腺发育和泌乳功能就成为了我们研究的重点。本研究以本实验室原代培养的奶牛乳腺上皮细胞(DCMECs)为模型,通过脂质体转染法在细胞中转染mi R-29s mimics/inhibitor,首先利用双荧光素酶活性检测及绿色荧光蛋白GFP表达检测进行了mi R-29s靶基因的验证;应用实时荧光定量及Western blotting技术检测DNMT3A/3B及泌乳相关基因表达的变化;采用重亚硫酸盐测序技术(BSP)分析了泌乳相关基因的启动子甲基化的改变;通过细胞中添加甲基转移酶抑制剂5-Aza-dc后观察了泌乳相关基因及mi R-29s表达的变化;使用CASY细胞活力分析仪检测活细胞数和细胞活力的变化;应用Ed U标记技术检测了对细胞增殖的影响;同时使用酪蛋白检测试剂盒、TG检测试剂盒和乳糖检测试剂盒检测了细胞分泌?-酪蛋白、甘油三酯和乳糖的能力。实验结果表明:(1)实时荧光定量PCR检测结果与小RNA测序结果基本一致,显示高乳品质奶牛乳腺组织中mi R-29s的表达与低乳品质及非泌乳奶牛乳腺组织相比均显著升高(P<0.05)。(2)靶基因验证实验表明,在奶牛乳腺上皮细胞中,DNMT-3A/-3B是mi R-29s的靶基因,mi R-29s能通过负调控DNMT3A/3B的表达降低细胞基因组DNA总体甲基化水平(GDM)及甲基转移酶的活力。(3)荧光定量PCR及Western Blotting检测结果显示,mi R-29s能影响奶牛乳腺上皮细胞中泌乳相关基因m RNA及蛋白的表达。过表达mi R-29s时奶牛乳腺上皮细胞中的AKT1、m TOR、ELF5、CSN1S1、SREBP1、PPARγ、GLUT1表达量均显著下降;抑制内源性mi R-29s表达时,细胞内AKT1、mTOR、ELF5、CSN1S1、SREBP1、PPARγ、GLUT1的表达均升高;推测mi R-29s对乳成分的合成及分泌具有重要的调控作用。(4)重亚硫酸盐测序结果表明,在奶牛乳腺上皮细胞中沉默mi R-29b时,Elf5、Csn1s1、Srebp1、Ppar G、Glut1启动子区域的DNA甲基化水平均有明显的升高,而Akt1及m TOR启动子区域的DNA甲基化水平没有明显变化。5-Aza-dc处理奶牛乳腺上皮细胞后,荧光定量PCR检测Elf5、Csn1s1、Srebp1、Ppar G、Glut1、Akt1、m TOR mRNA的表达,发现5-Aza-dc处理组与空白对照组相比Elf5、Csn1s1、Srebp1、Ppar G、Glut1的mRNA表达显著升高,Akt1、m TOR m RNA的表达无显著变化。实验结果表明mi R-29s主要通过调控DNA甲基化模式影响泌乳重要基因Elf5、Csn1s1、Srebp1、Ppar G、Glut1的表达,对Akt1、m TOR的调控机制还需要进一步研究。(5)用5-Aza-dc处理奶牛乳腺上皮细胞后,与空白对照组相比mi R-29a、mi R-29c的表达变化并不明显,mi R-29b的表达显著升高。重亚硫酸盐测序结果表明,与空白对照组相比,mi R-29b启动子区域甲基化明显升高。结果表明在奶牛乳腺上皮细胞中mi R-29b的表达受到DNA甲基化水平的调控。(6)应用CASY及Ed U标记技术发现,mi R-29s对奶牛乳腺上皮细胞的活力、细胞增殖均具有促进作用。检测奶牛乳腺上皮细胞分泌β-酪蛋白(CSN2)、乳糖及甘油三酯的结果表明,超量表达mi R-29a、-29b、-29c能促进乳蛋白、乳脂及乳糖的合成;沉寂mi R-29s对奶牛乳腺上皮细胞β-酪蛋白、甘油三酯及乳糖的分泌均有抑制作用,且5-Aza-dc能恢复或部分逆转mi R-29s抑制子对乳成分合成的抑制作用,提示mi R-29s对奶牛乳腺泌乳的调控与DNA甲基化作用密切相关。综上,mi R-29a、mi R-29b、mi R-29c为乳腺泌乳调控网络中的成员,通过调控其靶基因Dnmt3a/3b的表达影响奶牛乳腺上皮细胞DNA甲基化水平。泌乳相关基因启动子区域DNA甲基化水平的改变能引起基因表达的变化,进而影响乳腺细胞的增殖和乳成分的生成及分泌。mi R-29s通过调节奶牛乳腺上皮细胞DNA甲基化参与乳腺泌乳调控的作用机制的阐明为今后奶牛业乳品质的优化及乳腺泌乳生物学的研究提供了新的理论参考。