中枢神经系统真菌感染以隐球菌侵袭最为常见,临床上致病性隐球菌多为新生隐球菌和格特隐球菌。中国的流行病学研究表明:新生隐球菌患者部分为“免疫功能正常”的人群。这类患者在治疗上耗时长,疗效差。这就需要我们探索这类患者的隐球菌感染发病机制,为寻求该病更为有效的治疗提供理论探索和实验研究。单核细胞来源的巨噬细胞通常被认为是机体防御真菌感染的第一道防线中重要免疫细胞。抵御隐球菌感染需要诱导适当的固有免疫反应,而过度的免疫激活反而可能导致机体损伤或急慢性炎性疾病。有效的免疫调节来避免在隐球菌感染中诱发不当免疫应答反应,同时能及时清除入侵的病原体,在隐球菌发病中具有重要决定作用。因此,研究宿主在隐球菌入侵时的固有免疫系统中巨噬细胞与新生隐球菌的相互作用机制,对了解机体在新生隐球菌感染早期的免疫调节机制十分重要。Micro RNA(mi RNA)是在转录后水平上调节靶向基因表达的一类长度约为20~24 nt非编码小RNA分子,广泛存在于自然界各种病毒、线虫、植物及动物体内。研究发现,mi RNA通过抑制m RNA的翻译来广泛参与到生物基因表达、细胞分化、信号转导、免疫应答、肿瘤发生等多种生命活动中。近年来,越来越多的报道显示mi RNA在免疫细胞的分化、发育和功能调节中起到了至关重要的作用。mi RNA在固有免疫和适应性免疫细胞中通过特定的表达谱调节细胞的分化和功能,其表达和功能失调将导致各种病原体感染和免疫性疾病发生。本研究以mi RNA靶向单核巨噬细胞(THP-1细胞)MAPK∕NF-κB通路相关基因在新生隐球菌致病中的作用及机制为研究内容,探讨mi RNA靶向相关基因在新生隐球菌致病的相关作用机制。首先我们进行新生隐球菌(WN148)诱导人源单核巨噬细胞THP-1细胞mi RNA的差异表达筛选及靶基因生物信息学分析;观察mi R-146a、mi R-30b在THP-1细胞诱导组、健康人原代单核细胞组、“免疫活性正常”隐脑患者单核细胞组的表达规律;观察新生隐球菌诱导后THP-1的mi R-146a的诱导表达以及检测mi R-146a对MAPK∕NF-κB表达的影响;分析mi R-146a靶向IRAK1和TRAF6在新生隐球菌诱导THP-1中免疫调控作用及可能的机制,从而为进一步研究新生隐球菌在机体内的免疫作用机制提供基础的理论研究和实验数据依据。第一部分新生隐球菌诱导THP-1细胞中Micro RNA的差异表达及靶基因生物信息学分析我们筛选新生隐球菌(WN148)诱导单核巨噬细胞THP-1细胞后差异表达的mi RNA,并对这些mi RNA的靶基因进行预测和相关生物学信息分析。WN148诱导THP-1细胞0h、6h(分别代表对照组、干预组)后,收集细胞(每组n=4)。提取细胞总RNA电泳跑胶,回收12bp和30bp之间的小分子RNA,Illumina Hiseq2500进行深度测序分析。同时进行差异mi RNA的验证:收集各组细胞,提取总RNA;采用Takara公司Prime Script TMRT reagent Kit特异mi RNA的茎环引物进行c DNA逆转;采用SYBR?Premix Ex Taq TM II检测试剂盒,在ABI7900定量PCR仪上扩增和检测。选取使用U6作为内参照,mi RNA的相对表达量采用2-△△Ct计算。通过mi RWalk中的Validated targets方式获得mi RNA的Target gene;将获得的预测的Target基因列表进行通过DAVID进行GO(gene ontology,GO)富集分析基因功能的改变,KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)生物通路分析基因编码的蛋白间的相互关系。结果表明mi R-4792,mi R-30b-5p(mi R-30b),mi R-30c-5p,mi R-223-3p,mi R-15b-3p,mi R-146a-5p(mi R-146a),mi R-155-5p的表达上调,定量RT-PCR的验证结果与Illumina测序结果一致。这些mi RNA与免疫相关靶基因主要富集于细胞增殖、转录调控、细胞器代谢、细胞内信号传导、质膜转运、核酸活性调节等生物学功能上。其生物信息学通路显著富集于Cancer信号通路、MAPK信号通路、胞内因子相互作用、T细胞信号通路、Toll样受体调节、分子趋化黏附等通路。通过差异表达的mi RNA筛选以及其靶基因生物信息学,并对mi RNA参与免疫调控的分子机制进行研究,为下一步新生隐球菌发病机制的研究提供生物信息学指导和研究方向。第二部分差异表达mi R-146a、mi R-30b在各组细胞中表达规律研究我们选取mi R-146a、mi R-30b作为研究对象,分别观察他们在新生隐球菌诱导THP-1细胞诱导组、健康人原代单核细胞组、“免疫活性正常”隐脑患者单核细胞组的表达规律。新生隐球菌诱导组,按照数量之比为5:1比例将灭活隐球菌WN148与THP-1细胞进行共培养0h、3h、6h、9h、12h后,离心收集细胞沉淀;原代人单核细胞分离及纯化:从第二军医大学长征医院皮肤科和医学真菌学重点实验室获取隐球菌脑膜炎患者、健康人外周血样本,利用Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离原代人外周血单核细胞(PBMC),利用抗-CD14微珠(BD Bioscience公司)从PBMC中纯化单核细胞。收集各组细胞,提取总RNA,特异mi RNA的茎环引物进行逆转。在ABI7900定量PCR仪上扩增和检测,从而观察各组细胞mi R-146a、mi R-30b的表达规律。我们的研究显示在新生隐球菌诱导THP-1细胞组mi R-146a、mi R-30b的表达从0h开始增加,并在不同时间点达到表达峰值。mi R-146a同mi R-30b相比,在THP-1细胞基础水平要低,在新生隐球菌诱导下,THP-1细胞生产的mi R-146a的比mi R-30b上升更快,在3 h达到峰值。同时,在原代单核细胞组,隐脑患者组mi R-146a、mi R-30b的表达相对于健康组中比较紊乱。第三部分:mi R-146a在新生隐球菌诱导单核细胞表达规律的研究我们首先建立了新生隐球菌诱导的细胞模型,观察了新生隐球菌诱导THP-1细胞中mi R-146a表达水平变化;根据前面生物信息分析的结果,观察了参与mi R-146a表达的有密切关系MAPK∕N F-κB信号通路。我们用灭活隐球菌WN148与THP-1细胞进行共培养0h、3h、6h、9h、12h后,离心收集上清液和细胞沉淀,检测mi R-146a对MAPK信号通路NF-κB基因及炎症因子TNF-a、IL-1β表达的影响;使用PDTC(NF-κB抑制剂)干预THP-1细胞12h后,再进行灭活隐球菌WN148的诱导,进一步观测mi R-146a对NF-κB基因及炎症因子TNF-a、IL-1β表达的影响。为研究mi R-146a对mir-146a-NF-κB轴的调控机制,我们用mi R-146a mimics和mi R-146a inhibitor转染THP-1细胞6h时后,新生隐球菌诱导诱导3h,再进行相关的观察指标的研究。结果显示,mi R-146a的表达在隐球菌诱导3h达到高峰,然后逐渐从3h到12h减少。同时,NF-κB蛋白水平的表达是不断增加,TNF-a、IL-1β表达的水平在不断增加;使用NF-κB抑制剂处理后,TNF-a、IL-1β的表达较未干预组减少,同时mi R-146a的表达在隐球菌诱导THP-1细胞中受到抑制。结果提示mi R-146a的表达水平在新生隐球菌诱导早期显著增加,与炎性细胞因子的表达有关。mi R-146a表达依赖于NF-κB信号通路调控炎症因子的表达。THP-1细胞转染mi R-146a mimics和mi R-146a inhibitor,mi R-146a mimics组p65(NF-κB蛋白主要组分)表达显著减弱,mi R-146a inhibitor组,p65的表达升高,这意味着其可以显著调节NF-κB新生隐球菌引起的激活。两组在基因表达水平变化同一时间组变化不明显;mi R-146a通过mi R-146a mimics和mi R-146a inhibitor转染影响NF-κB的表达,从而进一步影响TNF-a和IL-1β的释放。这些数据表明mi R-146a通过对MAPK∕NF-κB途径发挥负调控作用,进而影响免疫反应的状态和强度。第四部分mi R-146a靶向作用于IRAK1和TRAF6调控MAPK通路相关基因的机制研究mi RNA通过与靶基因3’UTR互补结合发挥其生物学功能,我们通过Target Scan及Miranda等数据库对mi R-146a的靶基因进行了分析和预测,并结合文献报道选取mi R-146a的前期试验预测的靶基因IRAK1和TRAF6的m RNA作为新生隐球菌发病机制研究对象。已有的mi RNA生物信息学预测显示,IRAK1和TRAF6的3’UTR包含有与mi R-146a碱基配对的序列,我们构建了萤火虫荧光素酶表达载体载体进行研究,以海肾荧光素酶作为参照。通过双荧光素酶报告基因系统,检测过表达或沉默mi R-146a后对荧光素酶活力的影响;此外,通过荧光定量RT-q PCR、免疫印迹Western blot的方法检测IRAK1和TRAF6基因和蛋白质表达水平。我们测量发现mi R-146a可显著抑制报告基因质粒的荧光素酶活性,表明mi R-146a靶向作用IRAK1和TRAF6基因。mi R-146a mimics组,IRAK1和TRAF6的m RNA的表达影响不明显;IRAK1和TRAF6蛋白均显著低于mi R-146a mimics对照组。转染mi R-146a inhibitor组,IRAK1和TRAF6的m RNA的表达影响不明显;IRAK1和TRAF6蛋白均显著高于mi R-146a inhibitor对照组。我们研究表明,IRAK1和TRAF6表达受到mi R-146a转录后的调控,IRAK1和TRAF6 m RNA的表达量变化不明显,IRAK1和TRAF6蛋白质的表达受到明显调控。综合以上研究,我们发现mi R-146a在新生隐球菌刺激单核巨噬细胞的炎症反应的调节中起重要作用,MAPK∕NF-κB通路炎症性细胞因子的释放;mi R-146a通过针对IRAK1和TRAF6的负反馈调节抑制MAPK∕NF-κB在新型隐球菌诱导单核细胞中的表达,从而调控新型隐球菌入侵期间的免疫反应。总之,我们的结果提示的mi R-146a的可表示未来治疗靶标,用于调节到新生隐球菌感染宿主免疫反应状态。