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红花玉兰（Magnolia wufengensis）为2004年在湖北五峰天然次生林中发现的木兰科新种,属红花大乔木类型,具有极高的绿化、观赏及经济价值。近年来,红花玉兰系列新品种在我国南方山地和平原地区已广泛栽培,但推广至我国北方地区时,一直受困于越冬伤害,严重限制了其应用范围。为使红花玉兰能在我国北方地区顺利越冬,深入探究红花玉兰的冷响应机制是红花玉兰抗寒适应性研究的重要组成部分。本研究以红花玉兰为材料,对其采取自然降温、人工低温及喷施脱落酸（ABA）后低温处理,分析在该3种条件下红花玉兰的生理变化特征,继而采用转录组测序的方法,系统解析了红花玉兰冷响应及外源ABA提高红花玉兰抗寒性的分子机制,并验证了抗寒关键基因Mw CBF4的功能及其调控网络。研究成果为红花玉兰抗寒新品种的培育提供了理论基础。主要结果如下:1、探究了红花玉兰在北京地区抗寒性较差的主要原因。通过对比2015年至2017年北京和五峰地区的温度发现,9～10月北京地区的温度要高于五峰地区（分别高2.2和1.2℃）,11月北京地区的温度要显著低于五峰地区（低5.4℃）。而在这期间内,五峰地区红花玉兰体内叶绿素、IAA、ZT和GA含量的降低幅度比北京地区的高2.5%～26.2%,但其积累的渗透调节物质和ABA及抗氧化酶的活性比北京地区的高1.4%～66.0%,且植株的丙二醛含量和半致死温度低0.8%～63.4%。因此推测北京地区红花玉兰抗寒性差的主要原因是:9～10月北京地区的温度较高导致了红花玉兰冷适应过程启动较晚,而11月温度的骤降,导致植株没有充足的时间进行冷适应。2、构建了冷胁迫下红花玉兰的代谢网络。利用Illumina高通量转录组测序技术,对比了室温和低温胁迫处理下红花玉兰的转录变化,经过序列拼接、基因功能注释和差异表达分析,发现了3910个差异表达基因。然后通过GO和KEGG富集分析发现差异表达基因主要富集到了膜脂结构、信号转导、转录因子、次级代谢、光合、ROS清除等功能类别,根据这些基因的表达,首次构建了冷胁迫下红花玉兰的代谢网络,为抗寒新品种的培育提供了基因库。3、解析了外源ABA提高红花玉兰抗寒性的分子机制。通过对比低温和外源ABA诱导的红花玉兰冷响应的转录变化,发现外源ABA显著改变了红花玉兰的冷响应过程,仅有1039个差异表达基因是两者共有的,外源ABA引起了1500个特异基因的差异表达,经过层次表达聚类和GO富集分析发现外源ABA改变了低温胁迫下红花玉兰体内的激素代谢及其级联反应,显著提高了8个转录因子家族基因在低温胁迫下的表达水平,促进了低温胁迫下的信号转导、氨基酸和糖代谢、有机酸的生物合成和水解酶活性的提高,保护了低温胁迫下的光合作用,并加速了有害物质的清除,为抗寒新品种的培育奠定了理论基础。4、验证了Mw CBF4基因的功能。基于转录组测序结果,利用Race实验技术和染色体步移技术,获得了Mw CBF4及其启动子的序列信息。经过氨基酸序列同源性比对和系统进化分析,发现Mw CBF4聚类到CBF/DREB A-1到A-6六个亚组中的A1亚组,且其携带一个保守的AP2/ERF DNA结合域,两侧具有CBF的保守序列PKK/RPAGRx KFx ETRHP和DSAWR。在AP2结构域中,Mw CBF4携带缬氨酸-14（V14）和谷氨酸-19（E19）。Plant Care在线分析工具分析发现Mw CBF4基因的启动子序列含有32种顺式作用元件。而将Mw CBF4基因通过农杆菌介导的蘸花法转入到野生型拟南芥中,然后对转基因拟南芥进行低温和盐胁迫处理,结果发现Mw CBF4基因显著提高了拟南芥的抗寒性和耐盐性。此外,Mw CBF4基因的功能与ABA密切相关。5、首次构建了Mw CBF4基因的调控网络。以Mw CBF4基因启动子中的顺式作用元件为诱饵,通过酵母单杂交技术进行酵母文库的筛选,获得了能与Mw CBF4启动子中GARE-motif、MYB、G-box和ABRE顺式作用元件结合的10个上游调控基因,其中包括正调控基因4个（CES、ABF2/7/9）,负调控基因6个（MYB3/4、PIF1/3、PRR5、GA20ox1-B）;而以BD-Mw CBF4为诱饵,通过酵母双杂交技术筛选酵母文库,获得了Mw CBF4基因的6个互作基因:SOD、Chlb 1、GFPT、Ph II、RSH2和APY 1。基于以上结果构建了Mw CBF4基因的调控网络。6、明确了Mw RSH2基因可变剪切的主要剪切模式和剪切位点。确定了与Mw CBF4互作的Mw RSH2基因存在可变剪切,其通过不同的剪切方式产生了12种不同的拷贝,且包含“GU-AG”、“AU-AU”、“AC-AG”、“AC-UG”和“UU-GG”5种剪切位点。而Mw RSH2基因可变剪切的模式则主要包括正常剪切、外显子跳过、内含子不剪切、外显子跳过+3’和5’端剪切位置改变、切点竞争等5种方式。通过酵母双杂交的一对一验证发现Mw CBF4基因仅与Mw RSH2基因中的Splicing 1、Splicing 4、Splicing 5、Splicing 8和Splicing 11存在相互作用。综上所述,本研究探究了红花玉兰在北京地区抗寒性较差的主要原因,并基于转录组数据首次构建了冷胁迫下红花玉兰的代谢网络,系统解析了外源ABA提高红花玉兰抗寒性的分子机制,探明了外源ABA和非冻低温诱导的抗寒性差异的内部机理。同时,验证了Mw CBF4基因的功能,并首次构建了Mw CBF4基因的调控网络,明确了Mw RSH2基因12种可变剪切的主要剪切模式和剪切位点。本论文的研究结果以全面的视角为深入探究木本植物响应低温胁迫的机制提供了理论参考,并为红花玉兰抗寒新品种的培育奠定了理论基础。