单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)是革兰氏阳性、胞内寄生菌,广泛存在于水、土壤、食品加工环境等；能引起人或动物感染。人多因食用受其污染的食品发病,免疫力低下、孕妇和婴儿多发,可以引起脑膜炎、流产和败血症等,死亡率高达30%。2011年,美国共有28个州的147人因为食用污染李斯特菌的香瓜而引起的李斯特菌病,死亡30人。1964以来,我国大部分省份有零星的临床病例报告。LM感染宿主过程的每一步受特定毒力因子或调控蛋白的控制,主要包括黏附侵袭因子in1A和inlB、细胞间迁移因子ActA、PrfA调控子、SigB调控子等。在应激条件下,LM会启动一系列机制来应对包括食品在内的外环境和体内感染过程所遭受到的不利因素,尤其是酸性环境应激,如酸性发酵食品、胃酸以及宿主细胞吞噬体内低pH等。耐酸应激机制是其在酸性环境中持续生存的重要基础,也可能是成功建立感染的前提。LM拥有谷氨酸脱羧酶系统(GAD),在酸性条件下细胞内谷氨酸与质子结合形成γ-氨基丁酸,使胞内质子浓度降低；LM的F0F1-ATPase也参与维持细胞内pH (pHi)的稳态。本实验室前期分析表明,LM还拥有精氨酸脱亚胺酶(ADI)和鲱精胺脱亚胺酶(AgDI)系统,在其他细菌中这些酶类催化形成的NH3分子可与质子结合调节pHi。但这些酶在LM抗酸应激中是否发挥作用、如何发挥作用、其表达受哪些基因调控等方面鲜见报道。本研究旨在探明：(1)精氨酸脱亚胺酶在LM抗酸应激中的作用及其与致病力关系；(2)鲱精胺脱亚胺酶在LM抗酸应激中的作用机制；(3)精氨酸抑制因子ArgR对SigB和ADI系统的调控机制。1.单核细胞增多李斯特菌胞内pH测定方法及其应用本研究采用羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)建立了LM胞内pHi的快速荧光检测法,范围在5.5-8.5的pH与435nm和490nm波长光激发后在535nm处发射光强度的比值(荧光比率Ratio490/435)有很高拟合度(R2>0.99),说明Ratio490/435值变化反映菌体内pHi,应用该方法研究了不同LM菌株在无机酸和有机酸应激条件下的pHi变化趋势。在胞外pH(pHex)为5.5的有机酸应激条件下,3个LM菌株在20-30min内pHi略有下降,此后恢复至正常水平；在pHHex为4.5时,醋酸(AA)和乳酸(LA)应激60mmin后的pHi仍不见恢复,而柠檬酸(CA)应激30mmin后则见pHi恢复,盐酸(HA)应激对pHi的影响最小。2.单核细胞增多性李斯特菌的抗酸应激能力pH5.5的有机酸和无机酸应激显著影响LM的生长,虽然对菌株M7生长的影响更为显著,但该菌株在pH7.5培养基中的生长也不如其他3个菌株。在pH4.5条件下,除了无机酸HA和CA应激组有3株受试菌株在培养数小时后略呈现生长态势外,AA和LA应激条件下的LM生长受到抑制,表明不同酸应激对LM的生长抑制作用有一定的差异,AA和LA的作用强于CA和HA。不同酸应激条件下LM生长受抑制的程度与上述pHi的变化具有相关性。pH3.5的不同酸处理对LM是致死性的,存活率由高到低依次为HA>CA>LA>AA;相比而言,菌株M7的存活率最低。以pH2.5的人工胃液模拟宿主胃肠道环境,菌株M7同样表现出最弱的存活能力(仅0.03%),显著低于另3个菌株(1.17%-2.71%)。3.单核细胞增多性李斯特菌精氨酸脱亚胺酶的抗酸应激作用LM的ADI(由arcA编码)具备精氨酸脱亚胺酶家族经典的空间结构及保守的催化结构域和氨基酸位点,且有ADI酶活性。pH4.8的酸应激可显著提高arcA的转录和蛋白表达水平。缺失arcA后的LM在pH5.5培养基中的生长显著低于亲本菌株(P<0.01),基因回补可恢复其对酸的抵抗能力。与野生株相比,arcA缺失株在pH2.5的人工胃液中的存活能力显著降低(P<0.05)。arcA缺失株口服灌胃感染ICR小鼠1h和2h胃中的存活细菌数均显著低于野生株与回补株(P<0.01)。静脉注射感染小鼠48h和72h脾脏中的细菌数显著低于野生型菌株(Log1o CFU分别为4.1vs6.7和3.8vs6.9,P<0.01),基因回补株的脾脏菌数恢复至野生株水平。上述结果表明,LM的arcA编码蛋白具备ADI活性,且介导细菌在酸环境中的生长或存活能力,亦与致病性相关。4.单核细胞增多性李斯特菌双拷贝鲱精胺脱亚胺酶AguA1和AguA2介导抗酸应激差异的分子机制LM含有双拷贝的AgDI:AguA1和AguA2,分别由aguA1和aguA2编码,两者均具备与其催化活性相关的5个氨基酸活性位点(Cys356、Asp94、Asp218、 His216和Glu155)。aguA1和aguA2在ph5.0酸应激1h后的转录水平均显著上调(P<0.05)。aguAl缺失株在pH2.5的人工胃液中存活力显著低于野生株和回补株(P<0.01),而缺失aguA2对LM的存活能力无显著影响(P>0.05),aguAl和aguA2双缺失后的存活能力与aguAl缺失株相当。aguAl缺失株口服灌胃后1小时胃内的存活细菌数显著少于野生株与回补株(P<0.01),缺失aguA2后其存活细菌数没有受到显著影响(P>0.05)。由此表明,虽然双拷贝的鲱精胺脱亚胺酶AguA1和AguA2在酸应激下转录水平均显著上调,但只有AguA1介导LM在体外和体内的抗酸应激作用。重组表达的AguA1能够高效且特异性地催化鲱精胺,比活力高达2050.78U/mg,而AguA2无催化活性。AguA1的酶动力学参数Km、Vmax、kcat和kcat/Km值分别为0.65±0.23mM、85.69±7.58μM/min、34.28±3.03min-1和5.30×10min-1M-1,最佳反应温度25℃,最适反应pH范围比较宽泛,在pH3.5-10.5范围内均具有较高的反应活性。AguA1对储存温度敏感,25℃中存放6小时后活力几乎全部丧失。金属离子Co2+、Cu2+和Zn2+对AguA1的活性具有不同程度的抑制效应,其中Cu2+抑制最显著,IC50(半数抑制浓度)仅为0.026mM。AguA1的催化位点C356、D94、D218、H216、以及E155中任意一位突变后其酶活性均完全丧失。将AguA2特异性差异位点突变为AguA1中对应的氨基酸(Y47F、C157G、F196L、N236D和H360Q)后发现,AguA2天然无活性的原因主要是由于第157位Cys引起的,AguA2-C157G突变蛋白具有高活酶活；而将AguA1该位点进行G157C突变,酶活性完全丧失。因此,本研究首次证实LM双拷贝鲱精胺脱亚胺酶AguA1和AguA2的生物学功能差异主要在于两者第157位氨基酸位点。我们的研究首次发现并证实除了C356、D94、D218、H216以及E155位点外,G157位点为新发现的IM-AgDI关键氨基酸,且同样决定了其催化活性。5.单核细胞增多性李斯特菌精氨酸抑制因子ArgR调控抗酸应激机制LM精氨酸抑制因子ArgR属于ArgR/AhrC转录调控因子家族,参与精氨酸代谢的调控。ArgR与其他同源蛋白的亲缘性比较近,且存在该家族蛋白两个重要的结构域(启动子结合区“SR”和精氨酸结合区"GTLAGDTT")。ArgR与细菌的酸应激存活能力密切相关,ArgR缺失后导致细菌在致死性酸应激下的存活能力显著增强(P<0.01)。EMSA显示,ArgR能够与arcA、sigB、argC和argG启动子区的ArgR box发生结合,结合能力存在明显的差异,即argC>argG>sigB>arcA。ArgR的“SR”氨基酸置换(S42A和R43A)后与被调控基因启动子的结合能力明显减弱或丧失,证实这两个位点为ArgR与启动子结合的关键氨基酸。在pH5.5酸应激显著上调argR的转录水平,argR缺失显著提高argG的转录和蛋白表达量(包括报告基因gfp3的表达水平),表明其对精氨酸合成起负调控作用。酸应激条件下argR缺失株的arcA转录和表达水平显著提高,同样提高的还有sigB转录和表达水平,初步表明ArgR也负调控精氨酸的分解代谢,但是由于arcA的表达同样受sigB正调控,ArgR对arcA的负调控并不一定是直接作用,可能是通过sigB起作用。当添加外源性精氨酸后,argG在应激和非应激下的转录和表达同样受ArgR显著抑制,而ArgR对sigB和arcA的抑制效应却解除。本研究表明ArgR在非应激和酸应激状态下能够反馈负调控精氨酸合成代谢通路基因argC和argG,且首次发现ArgR缺失能够增强细菌的酸应激存活能力,研究推测该变化是由于ArgR参与负调控抗酸应激功能和调控基因(arcA和sigB)的转录及表达而引起。综上所述,本研究探明了LM的arcA基因编码产物具有ADI酶活性,aguA1编码产物具有AgDI酶活性；新发现了第157位甘氨酸对酶活性的重要作用,将AguA2的第157位氨基酸进行C157G突变后即具有高酶活；ADI和AgDI均介导LM的抗酸应激作用及其在小鼠胃中的存活力；精氨酸抑制因子ArgR不仅负调控精氨酸合成代谢,对应激调控因子SigB以及精氨酸脱亚胺酶ADI也具有调控作用,但其精确的调控机制和网络还有待深入研究。