论文部分内容阅读
癌症已成为当今世界威胁人们生命健康的主要杀手之一。目前治疗癌症最主要的方法同样是放疗和化疗。但是放疗和化疗对身体的所引起的副作用,往往给人们带来更多的痛苦。红豆杉中提取和分离出的紫杉醇在抗癌方面的神奇作用,给癌症患者带来了福音。但是,由于红豆杉生长及其缓慢,并且紫杉醇含量极低,完全不能满足当今医疗界的需求。再加上传统的分离提取紫杉醇的方法效率低下,使得供不应求的矛盾越来越明显。随着现代生物技术的迅速发展,尤其是基因工程技术的不断提高,为通过基因工程技术对红豆杉资源进行遗传改良,以提高红豆杉中的紫杉醇含量,或者实现紫杉醇的发酵批量化生产,为解决类似紫杉醇等药物资源匮乏而需求量又巨大的问题提供了一个崭新的思路。对于此,进行紫杉醇生物合成的分子生物学研究,是开展紫杉醇基因工程的首要工作。紫杉醇的生物合成起源于新近发现的MEP途径。本实验通过rapid-amplification of cDNAends(RACE)技术,从南方红豆杉中克隆出了MEP途径上的关键酶基因的全长cDNA,即TcDXS(南方红豆杉1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因)以及TcDXR(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸异构酶基因)的编码区,并对其进行了蛋白表达和组织差异表达分析以及功能验证。1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase, DXS)为紫杉醇前体生物合成MEP途径上的第一个酶。通过cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)方法,从南方红豆杉中获得了DXS基因(TcDXS)。TcDXS全长3031bp,包括5’和3’非翻译区、polyA尾巴和一个编码为2229个碱基的开放阅读框(open reading frame,ORF),它编码一条742个氨基酸残基的DXS蛋白质,通过预测得知其分子量为79.4kDa,等电点为7.9。运用荧光定量PCR技术分析该基因在主根、侧根、茎、老叶、幼叶、老叶柄、幼叶柄、皮等八个组织中的表达差异显示,TcDXS在红豆杉根、叶、树皮、茎中均有组成型表达,在幼嫩的叶柄中表达较多。通过颜色互补试验表明TcDXS可以使宿主菌超量积累β-胡萝卜素。通过构建TcDXS蛋白的原核表达载体表达出了重组蛋白,为进一步的酶活性检测做好准备。对TcDXS基因的克隆和功能分析将更有助于了解紫杉醇前体合成途径中的关键调控靶点。1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸异构酶(DXR)是位于DXS催化反应之后的第二个反应酶。本实验通过基因特异性引物,克隆出了用于构建高效植物表达载体、蛋白原核表达载体的编码区。并通过荧光定量PCR技术对其进行组织差异表达分析,结果显示在所检测的南方红豆杉的八个组织中,TcDXR在皮、侧根和绿色组织中的表达量远远高于主根和茎,并且叶柄中的表达高于叶中的表达。该基因的原核表达结果显示,所表达的重组蛋白大小与预测的大小一致,为进一步的蛋白质酶活性检验证做了前期准备。用于遗传转化的工程菌,即分别携带p1304+-TcDXR和p1304+-TcDXR+STR构建成功,为下一步通过遗传转化验证DXR基因的功能打下基础。