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目的：基于“肾主骨”理论，探讨补肾滋阴代表方剂左归丸促进骨形成作用，及JNK、p38/Smads信号级联对其影响，以探讨左归丸潜在促进骨形成的作用机制。材料与方法：采用血清药理学方法，将SPF级SD雌性大鼠60只（180~220g）按体质量随机分为空白对照组、左归丸组和倍美力组，每组各20只，依据人与大鼠等剂量换算公式折算大鼠左归丸等临床剂量为1.6g·Kg-1，大鼠倍美力结合雌激素片的等临床剂量为56.25μg·kg-1，使用前用蒸馏水将药物制成混悬液，空白对照组给予蒸馏水，灌服10ml·Kg-1体质量，2次·d-1，连续灌胃7d，末次给药2h后，麻醉大鼠，腹主动脉取血，室温静置2h，2500r·min-1，4℃离心20min，收集上清，同组血清混匀，56℃水浴灭活30min，制备大鼠含药血清。采用MC3T3-E1成骨细胞系体外研究模型，用含10%FBS的α-MEM培养液（100U·ml-1青霉素和100μg·ml-1链霉素）培养。细胞实验分为空白对照组（control）、SP600125组（SP）、SB203580组（SB）、左归丸组（ZG）、左归丸+SP600125组（ZG+SP）、左归丸+SB203580组（ZG+SB）、倍美力组（BML）、倍美力+SP600125组（BML+SP）、倍美力+SB203580组（BML+SB）。细胞接种24h后，换用含0.2%FBS的α-MEM培养液（100U·ml-1青霉素和100μg·ml-1链霉素），饥饿24h，吸弃旧培养液，加入含或不含JNK、p38MAPK特异抑制剂SP600125、SB203580(10μmol·L-1，溶于DMSO，体积分数<0.1%)的α-MEM培养液（100U·ml-1青霉素和100μg·ml-1链霉素），预处理60min后，各组加入相应血清（阴性对照孔、control组、SP组、SB组加入空白对照大鼠血清，ZG组、ZG+SP组、ZG+SB组加入左归丸大鼠含药血清，BML组、BML+SP组、BML+SB组加入倍美力大鼠含药血清），体积分数为15%，孵育48h。采用蛋白质印迹Western blot测定JNK和p38MAPK磷酸化蛋白表达水平，采用免疫荧光染色法进一步验证JNK和p38MAPK磷酸化蛋白表达水平。采用MTT法检测MC3T3-E1细胞增殖；采用流式细胞术分析细胞周期。采用对硝基苯磷酸盐(PNPP)法和改良钙钴染色法检测MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶（ALP）活性；采用茜素红染色法检测MC3T3-E1细胞钙化结节形成。采用Western blot分析OB分泌蛋白情况，检测核结合因子（Runx2）、ALP、Ⅰ型胶原（ColI）、Smad2/3、 p-Smad2和p-Smad3蛋白表达水平。采用Q-PCR技术测定相关基因mRNA表达水平，检测MC3T3-E1细胞转化生长因子β1（TGF-β1）、Smad4、Runx2和ColI mRNA表达水平。结果：1.JNK信号通路参与左归丸含药血清诱导MC3T3-E1细胞分化的调控1.1左归丸含药血清能够诱导MC3T3-E1细胞JNK信号通路活化结果显示，与control组比较，ZG和BML均能显著诱导MC3T3-E1细胞JNK蛋白磷酸化；ZG显著优于BML；加入SP600125后，显著抑制ZG和BML对JNK蛋白磷酸化的诱导作用。1.2JNK信号通路主要在分化晚期参与左归丸含药血清对MC3T3-E1细胞ALP活性的调控结果显示，与control组比较，ZG和BML均能显著诱导MC3T3-E1细胞48h和7d的ALP活性（P＜0.01）；对于48h的ALP活性的影响，ZG组显著优于BML组（P＜0.01）；加入SP600125后，显著抑制BML对48h和7d的ALP活性的刺激作用（P＜0.01），对ZG诱导48h的ALP活性的影响没有统计学意义（P>0.05），但显著抑制了ZG诱导7d的ALP活性。1.3JNK信号通路参与左归丸含药血清促进MC3T3-E1细胞矿化作用的调控结果显示，与control组比较，ZG和BML均能显著诱导MC3T3-E1细胞14d的矿化作用；加入SP600125后，显著抑制ZG和BML对矿化作用的诱导。1.4JNK信号通路对左归丸含药血清干预Runx2和ALP蛋白表达的影响结果显示，与control组比较，ZG和BML均能显著上调MC3T3-E1细胞48h的Runx2和ALP蛋白的表达；加入SP600125后，未能对抗ZG诱导48h的Runx2和ALP蛋白表达，也未能对抗BML诱导的Runx2蛋白的表达，但显著抑制了BML诱导的ALP蛋白表达。2.p38MAPK信号通路参与左归丸含药血清诱导MC3T3-E1细胞分化的调控2.1左归丸含药血清能够诱导MC3T3-E1细胞p38MAPK信号通路活化结果显示，与control组比较，ZG和BML均能显著上调MC3T3-E1细胞p38磷酸化蛋白的表达；加入SB203580后，显著抑制ZG和BML对p38蛋白磷酸化的诱导作用。2.2p38MAPK信号通路参与左归丸含药血清对MC3T3-E1细胞分化不同阶段ALP活性的调控结果显示，与control组比较，ZG和BML均能显著诱导MC3T3-E1细胞48h和7d的ALP活性（P＜0.01）；加入SB203580后，显著抑制ZG和BML对48h和7d的ALP活性的刺激作用（P＜0.01）。2.3p38MAPK信号通路参与左归丸含药血清促进MC3T3-E1细胞14d矿化作用的调控结果显示，与control组比较，ZG和BML均能显著诱导MC3T3-E1细胞14d矿化作用；加入SB203580后，显著抑制ZG和BML对细胞矿化的诱导作用。2.4左归丸含药血清通过p38MAPK信号通路的活化上调Runx2蛋白的表达结果显示，与control组比较，ZG和BML均能显著上调MC3T3-E1细胞Runx2蛋白的表达；加入SB203580后，显著抑制ZG和BML对Runx2蛋白表达的诱导。3.JNK、p38MAPK/Smads信号级联参与左归丸含药血清对MC3T3-E1细胞功能的调控3.1左归丸含药血清上调MC3T3-E1细胞TGFβ1mRNA表达结果显示，与control组比较，ZG组和BML均组能显著上调MC3T3-E1细胞TGFβ1mRNA的表达（P＜0.01）。3.2左归丸含药血清诱导MC3T3-E1细胞磷酸化JNK和磷酸化p38蛋白表达结果显示，与control组比较，ZG组和BML组均能显著诱导MC3T3-E1细胞磷酸化JNK和p38蛋白的表达；ZG组明显优于BML组；加入SP600125或SB203580后，显著抑制ZG和BML对磷酸化JNK或p38蛋白的诱导作用。3.3JNK和p38MAPK信号通路参与左归丸含药血清干预MC3T3-E1细胞增殖的调控结果显示，与control组比较，ZG和BML均能显著促进MC3T3-E1细胞增殖（P＜0.01）；ZG组显著优于BML组（P＜0.01）；加入SP600125或SB203580后，抑制ZG组和BML组对MC3T3-E1细胞增殖的诱导作用（P＜0.05或P＜0.01）。3.4JNK和p38MAPK信号通路参与左归丸含药血清干预MC3T3-E1细胞周期分布的调控细胞周期分析结果显示，与control组比较，ZG组G1期的细胞百分率显著下降（P＜0.01），S期的细胞百分率变化不显著（P>0.05），G2/M期的细胞百分率显著增加（P＜0.01）；与ZG组比较，ZG+SP组和ZG+SB组显著抵抗了ZG对细胞周期的调控作用（P＜0.01）。3.5左归丸含药血清活化JNK和p38MAPK信号通路有助于磷酸化Smad2/3和上调ColI蛋白表达结果显示，与control组比较，ZG和BML均能显著诱导MC3T3-E1细胞Smad2/3蛋白磷酸化和上调ColI蛋白表达水平（P＜0.01）；对p-Smad2的诱导作用，ZG组显著优于BML组（P＜0.01），对ColI蛋白表达的上调作用，ZG组优于BML组（P＜0.05），对p-Smad3的诱导作用，两组比较无统计学意义（P>0.05）；加入SP600125或SB203580后，显著抑制ZG和BML对MC3T3-E1细胞Smad2/3蛋白磷酸化的诱导作用（P＜0.01），显著抑制ZG对MC3T3-E1细胞ColI蛋白表达的上调作用（P＜0.01），加入SP600125后显著抑制BML诱导的ColI蛋白表达（P＜0.01），加入SB203580后抑制BML诱导的ColI蛋白的表达（P＜0.05）。3.6左归丸含药血清干预Smad4、Runx2和ColI mRNA表达作用及JNK和p38MAPK通路对其影响结果显示，与control组比较，ZG和BML均能显著上调MC3T3-E1细胞Smad4、Runx2和ColI mRNA的表达（P＜0.01）；对Smad4和Runx2mRNA表达诱导作用ZG组与BML组比较无统计学意义（P>0.05），对ColI mRNA诱导作用ZG组显著优于BML组（P＜0.01）；加入SP600125后，对ZG诱导Smad4和Runx2mRNA表达的抑制作用没有统计学意义（P>0.05），可以显著抑制ZG诱导的ColI mRNA表达（P＜0.01），对BML诱导的ColI mRNA表达的抑制作用没有统计学意义（P>0.05），可以抑制BML诱导的Smad4和Runx2mRNA的表达（P＜0.05或P＜0.01）；加入SB203580后，对ZG诱导Smad4mRNA表达的抑制作用没有统计学意义（P>0.05），可以显著抑制ZG诱导的Runx2和ColI mRNA表达（P＜0.01），对BML诱导的Smad4mRNA表达的抑制作用没有统计学意义（P>0.05），可以抑制BML诱导的Runx2和ColI mRNA的表达（P＜0.05或P＜0.01）。结论：1.左归丸含药血清具有诱导MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化作用。2.JNK、p38MAPK/Smads信号级联参与MC3T3-E1细胞的增殖与分化。3.左归丸含药血清可能部分通过活化JNK和p38MAPK通路调控MC3T3-E1细胞功能。4.左归丸含药血清可能部分通过对JNK、p38MAPK/Smads信号级联的调节而达到促骨形成作用。