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研究背景:生殖支原体(Mycoplasma genitalium,Mg)是一种缺乏细胞壁、能在无生命培养基中生长繁殖的最小原核细胞型微生物,可导致多种泌尿生殖系统疾病。生殖支原体黏附蛋白(M.genitalium protein of adhesion,MgPa)介导Mg黏附并入侵宿主细胞,本课题组前期研究证实亲环蛋白A(Cyclophilin A,CypA)是MgPa的受体。而环孢素A(Cyclosporin A,CsA)与CypA结合后可调控钙调磷酸酶(Calcineurin,CaN)的表达,抑制活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)的核转位、降低IL-2、INF-γmRNA的转录,从而抑制T细胞的活化。本研究拟证实MgPa与宿主T细胞膜上的CypA相互作用对T细胞活化的影响,以进一步阐明Mg对宿主细胞的免疫抑制机制。研究目的:研究MgPa与人T细胞表面CypA受体结合后形成的MgPa-CypA复合物是否能下调T细胞CaN-NFAT信号通路,进而抑制T细胞的活化以发挥其免疫抑制功能,以进一步阐明MgPa的生物学功能及Mg的免疫抑制机制。研究方法:1.间接免疫荧光检测CypA在T细胞的分布及转染pcDNA3.1(+)/MgPa后的T细胞中MgPa-CypA的共定位和胞内互作;2.间接免疫荧光检测Mg和重组MgPa(rMgPa)黏附与入侵T细胞的情况,并检测CypA蛋白和CypA抗体能否抑制rMgPa对T细胞的黏附;3.免疫印迹实验(Western blot,WB)检测CypA-siRNA转染细胞后CypA的表达情况;4.间接酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western Blot检测rMgPa预处理活化T细胞CaN的磷酸化/含量;5.间接免疫荧光法检测rMgPa抑制活化T细胞NFAT的核转位现象;6.实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和ELISA分别检测rMgPa抑制T细胞活化后IL-2和IFN-γmRNA转录水平和蛋白表达水平;7.流式细胞术检测rMgPa对T细胞表面活化分子CD25、CD69和胞内细胞因子IL-2和IFN-γ的抑制情况。研究结果:1.CyPA主要分布在细胞质基质和细胞膜上,可与rMgPa共定位于T细胞的胞膜;2.Mg经rMgPa能黏附并入侵T细胞内,CypA蛋白和CypA抗体能抑制rMgPa对T细胞的黏附;3.rMgPa能抑制T细胞CaN的磷酸化/含量,CypA-siRNA干扰CypA表达后能减弱rMgPa抑制T细胞CaN磷酸化/活性的含量;4.rMgPa能抑制T细胞内NFAT的核转位,而利用CypA-siRNA技术干扰CypA的表达后,T细胞内NFAT的核转位现象增强;5.rMgPa能抑制活化T细胞IL-2、INF-γmRNA转录水平和蛋白表达水平,与rMgPa实验组相比,CypA-siRNA干扰组T细胞IL-2、INF-γ的mRNA转录和蛋白表达水平显著增加(P<0.05);6.未刺激T细胞组IL-2、INF-γ、CD25和CD69的表达水平较低,CD3/CD28抗体刺激T细胞后其IL-2、INF-γ、CD25和CD69的表达水平显著升高(P<0.05)。rMgPa或CaN抑制剂组T细胞IL-2、INF-γ、CD25和CD69的表达水平明显下调(P<0.05),而rMgPa预处理的CypA-siRNA干扰组T细胞的IL-2、INF-γ、CD25和CD69的表达水平明显升高(P<0.05)。结论:1.MgPa可与T细胞膜上的CypA受体结合从而介导Mg黏附并入侵T细胞内;2.生殖支原体MgPa经CypA-CaN-NFAT信号通路抑制T细胞活化。