第一部分脂肪干细胞的分离、纯化及培养目的:建立一种分离、纯化及培养SD大鼠脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)简便有效的方法,为组织工程学提供理想的种子细胞。方法:1、选健康成年SD雄性大鼠,大鼠腹部和腹股沟处剪取皮下脂肪,采用酶消化法分离出脂肪干细胞,通过体外培养及连续传代方法,纯化、扩增脂肪干细胞。2、倒置相差显微镜观察ADSCs的形态学变化,用免疫荧光法检测表面抗原CD44表达情况。3、分离培养的脂肪干细胞行成软骨、成骨诱导分化,特定试剂进行细胞染色,确定脂肪干细胞的分化潜能。结果:1、取材4h后可见细胞贴壁,散在分布,48 h后贴壁细胞有触角伸出,体积增大,呈纤维细胞样的短梭形,颗粒逐渐增多,五六天后细胞呈集落样生长,细胞变为长梭形,旋涡状排列,传代后,细胞形态均一,克隆形成。2、荧光显微镜下观察到红色荧光,DAPI复染核呈蓝色,ADSCs细胞表面抗原CD44呈阳性表达。3、脂肪干细胞成软骨诱导后分化形成质地致密的细胞团,然后使用阿利新蓝染色,镜下观察细胞内呈现大量蓝色基质颗粒;成骨诱导后分化使用茜素红染色可见大量橘红色的钙结节。结论:酶消化法分离、贴壁纯化传代出的脂肪干细胞,生长状态良好、增殖速度快、纯度高,是一种简便而有效的分选培养方法,可得到理想的种子细胞,为后续的实验提供可靠的、稳定的细胞来源。第二部分Wnt通路和Sox9相互反馈调节脂肪干细胞成软骨分化中的作用目的:研究Wnt通路对脂肪干细胞成软骨分化能力的影响,观察Sox9在脂肪干细胞成软骨诱导分化过程中的表达,重点研究两者相互之间的关联,探讨Wnt通路调控脂肪干细胞成软骨分化的作用机制。如果能够将其应用于临床,相信能够为骨关节中关节软骨组织缺损后修复、再生,提供实验依据,对ADSCs在促进骨关节康复治疗领域的进一步广泛应用意义重大。方法:1、激动剂LiCL刺激干预脂肪干细胞后,CCK-8法观察ADSCs增殖活性及Western blot检测PCNA蛋白的表达情况。2、脂肪干细胞成软骨诱导分化各时期,对软骨指标Sox9、Aggrecan、Collagen2a及Wnt通路关键分子β-catenin进行Western blot、RT-q PCR层面的检测,用以评估其向软骨分化的能力。3、激动剂LiCL、抑制剂Dkk-1刺激干预脂肪干细胞成软骨诱导分化,重点检测干预后第7天(早期)、第21天(晚期),软骨指标Sox9、Aggrecan、Collagen2a及Wnt通路关键分子β-catenin的蛋白及m RNA的表达情况。4、脂肪干细胞成软骨诱导分化第21-35天(后期),RT-q PCR检测成熟软骨Collagen2a、Collagen10及早期成骨分化指标RUNX2的m RNA水平,Western blot检测Sox9、β-catenin蛋白的表达情况。5、激动剂LiCL、抑制剂Dkk-1刺激干预脂肪干细胞成软骨诱导分化第28天(后期),Western blot检测Sox9、β-catenin蛋白水平及Collagen2a、RUNX2蛋白分化指标。6、采用慢病毒作为载体,将Sox9基因转染进脂肪干细胞,使其得到稳定表达,RT-q PCR检测成软骨诱导分化过程中特异性标志物Collagen2a、Aggrecan表达水平,定量测定分泌型糖胺多糖(glycosaminoglycanes GAG)的含量。同时,对Sox9、β-catenin进行Western blot蛋白层面的检测,用以评估其向软骨分化的能力。7、Sox9慢病毒载体阳性转染脂肪干细胞成软骨诱导分化第21天,免疫荧光检测Collagen2a的表达,Western blot检测Wnt通路相关蛋白β-catenin、GSK-3β、p-β-catenin蛋白的表达情况;结果:1、激动剂LiCL刺激脂肪干细胞后,ADSCs增殖能力增强,且PCNA蛋白呈现高表达。2、软骨指标Sox9、Aggrecan、Collagen2a的逆转录基因及蛋白表达随着时间延长呈现增多态势;GAG的含量也呈现增多态势,且在第14天增加显著。而Wnt通路关键分子β-catenin蛋白则先减少后增加。3、成软骨诱导分化第7天(早期)、第21天(晚期),LiCL促进Sox9、Aggrecan、Collagen2a、β-catenin蛋白表达,Dkk-1抑制各软骨指标表达;4、成软骨诱导分化第21-35天(后期),随着时间的推移,Collagen2a表达逐渐减少;RUNX2、Collagen10的m RNA表达逐渐增多,β-catenin蛋白表达逐渐增多,Sox9蛋白表达则逐渐减少。LiCl促进β-catenin蛋白表达,同时下调Sox9、Collagen2a蛋白的表达,DKK-1组结果则相反。5、Sox9慢病毒载体阳性转染脂肪干细胞后,设置为转染组,其Collagen2a、Aggrecan m RNA水平明显高表达,GAG的含量测定也明显高表达;Western blot检测,Sox9慢病毒转染组显著低表达。6、成软骨诱导分化第21天(晚期),免疫荧光检测显示Sox9慢病毒转染组Collagen2a明显高表达;Western blot检测GSK-3β、p-β-catenin蛋白水平增高。结论:1、LiCL能激活Wnt通路关键蛋白β-catenin,在成软骨诱导分化中促进脂肪干细胞快速增殖。2、LiCL能激活Wnt通路关键蛋白β-catenin,在早期调控Sox9促进成软骨诱导分化,快速增殖;晚期继续调控Sox9促进成软骨诱导分化,后期慢慢下调Sox9,减弱成熟软骨表型表达,使软骨变得肥大、早期成骨增生。Dkk-1刺激可抑制Wnt通路,起相反作用。3、Sox9过表达可反馈抑制β-catenin蛋白的表达,促使其降解,维持成软骨诱导的分化。