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1目的在中医学“整体局部辨证统一”理论指导下,探讨肺癌的中医学发生发展病机,通过理论研究,揭示肺癌发病的本质及治法;从PD-1/PD-L1和PTEN/PI3K/Akt信号通路出发,通过实验研究,采用LLC肺癌细胞株传代培养移植法构建小鼠体内移植瘤模型,检测药物干预后上述通路相关分子表达变化,观察益气养阴、消积抗癌方药芪玉三龙汤对非小细胞肺癌的作用,探讨其治疗肺癌的分子机制,为中医药辅助治疗肺癌提供科学依据。2方法2.1理论研究搜集筛选关于肺癌的中医病因病机相关文献,分类提炼,总结出肺癌中医学发生发展病机,揭示肺癌发病的本质及治法,并通过文献研究阐述PD-1/PD-L1、PTEN/PI3K/Akt的结构功能及其与肺癌的相关性,为进一步实验研究芪玉三龙汤辅助治疗肺癌提供理论基础。2.2实验研究2.2.1构建模型采用LLC肺癌细胞株传代培养移植法构建小鼠体内肺癌移植瘤模型。常规培养传代LLC肺癌细胞株,取对数生长期细胞,胰酶消化,离心收集细胞,1 800 r/min离心5 min,以无血清的高糖DMEM培养基重悬稀释细胞,调整细胞浓度为1×107/m L,1 m L注射器吸取细胞悬液0.2 m L注射于C57BL/6小鼠左侧腋部皮下,构建小鼠皮下移植瘤动物模型。2.2.2动物分组及给药方法接种10天后,检测小鼠皮下摸到3-5mm3的米粒样硬物说明造模成功。将荷瘤小鼠随机分为模型组,化疗组,芪玉三龙汤高、中、低剂量组,联合组(芪玉三龙汤+顺铂),每组8只。(1)模型组(M):0.2 m L/10 g生理盐水灌胃10天,并分别于第1、3、5天腹腔注射生理盐水0.4 m L;(2)化疗组(C):0.2 m L/10 g生理盐水灌胃10天,并分别于第1、3、5天腹腔注射DDP溶液0.4 m L;(3)芪玉三龙汤高剂量组(QH):80.48 g/kg(临床成人日用剂量的4倍)中药药液灌胃10天,并分别于第1、3、5天腹腔注射生理盐水0.4 m L;(4)芪玉三龙汤中剂量组(QM):40.24 g/kg(临床成人日用剂量的2倍)中药药液灌胃10天,并分别于第1、3、5天腹腔注射生理盐水0.4 m L;(5)芪玉三龙汤低剂量组(QL):20.12 g/kg(临床成人日用剂量的1倍)中药药液灌胃10天,并分别于第1、3、5天腹腔注射生理盐水0.4 m L;(6)联合组(CQH):80.48 g/kg中药药液灌胃10天,并分别于第1、3、5天腹腔注射DDP溶液0.4 m L。2.2.3检测指标2.2.3.1观察芪玉三龙汤是否具扶正作用给药后每天观察并详细记录各组小鼠的精神状态、活动变化、进食情况、消瘦程度、毛发变化等一般生存情况。HE染色观察各组小鼠肺脏组织病理形态变化。实时荧光定量PCR法(RT-q PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测荷瘤小鼠脾脏PD-1及肿瘤组织PD-L1的m RNA转录水平和蛋白表达水平。酶联免疫法(ELISA)检测各组小鼠脾脏中Th1、Th2细胞因子含量。2.2.3.2观察芪玉三龙汤是否具消积作用检测各组小鼠移植瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。称取瘤质量,计算抑瘤率。透射电镜观察肿瘤细胞的超微结构变化。RT-q PCR法及Western blot检测PTEN/PI3K/Akt信号通路相关分子的基因转录水平和蛋白表达变化。3结果3.1理论研究肺癌的中医学病因病机乃正气亏虚,痰瘀癌毒积聚,日久形成肺部有形积块。PD-1/PD-L1共刺激信号通路在肺癌的激活可致肿瘤细胞产生免疫逃逸,现代医学研究认为中医学正气与免疫密切相关。PI3K/Akt/m TOR为肺癌中最常见失调信号通路之一,mi RNA21为致癌基因之一,其靶基因PTEN可负向调控该通路活化。芪玉三龙汤具有益气养阴,解毒抗癌功效,故可能介导上述两条信号通路“扶正消积”辅助治疗肺癌。3.2实验研究3.2.1芪玉三龙汤具有扶正作用3.2.1.1芪玉三龙汤对荷瘤小鼠一般生存情况及肺脏病理形态变化的影响小鼠一般生存情况:模型组小鼠精神状态一般,活动度、进食尚可;化疗组小鼠精神状态、活动度、进食情况、毛色光泽度均最差,消瘦厉害;芪玉三龙汤各组小鼠精神状态、活动度、饮食情况一直尚佳;联合组小鼠的生存状态较中药各组欠佳,但明显优于化疗组。肺脏病理形态变化:模型组、化疗组、芪玉三龙汤低剂量组肺内可见肿瘤转移灶,高、中剂量组及联合组未见肿瘤转移灶。3.2.1.2芪玉三龙汤对小鼠脾脏组织PD-1及肿瘤组织PD-L1 m RNA转录水平的影响与模型组比较,芪玉三龙汤高剂量组能降低PD-1、PD-L1 m RNA转录水平(P<0.01);化疗药对PD-L1 m RNA的降低不具统计学意义(P>0.05),两药联用对PD-1 m RNA、PD-L1 m RNA的表达无统计学意义(P>0.05)。3.2.1.3芪玉三龙汤对小鼠脾脏组织PD-1及肿瘤组织PD-L1蛋白水平表达的影响与模型组比较,芪玉三龙汤、化疗药均可降低PD-1、PD-L1蛋白表达水平,差异有显著统计学意义(P<0.01);与化疗组相比,二者联用对PD-1的表达无交互效应(P>0.05),但对PD-L1的表达具有交互效应(P<0.05)。3.2.1.4芪玉三龙汤对对各组小鼠脾脏Th1、Th2细胞因子含量的影响Th1:与模型组比较,芪玉三龙汤高剂量组IL-2、IFN-γ含量水平明显升高(P<0.01);与化疗组比较,各中药组的IL-2含量水平亦明显升高(P<0.01),但联合组升高不明显(P=0.56),各中药组及联合组IFN-γ含量均有所升高(P<0.01)。Th2:与模型组比较,芪玉三龙汤高剂量组能显著下调IL-4、IL-10水平(P<0.01),联合组稍能降低IL-4水平(P<0.05);与化疗组比较,中药及联合用药均可下调IL-4、IL-10含量(P<0.01)。3.2.2芪玉三龙汤具有消积作用3.2.2.1芪玉三龙汤对各组小鼠肿瘤宏观变化及肿瘤细胞超微结构的影响肿瘤组织宏观变化:化疗药可明显减小肿瘤体积、降低肿瘤质量(P<0.01),芪玉三龙汤对肿瘤体积及质量的抑制作用不明显,差异无统计学意义(P>0.05),二者联合的交互作用亦无统计学意义(P>0.05)。联合组和化疗组的抑瘤率相当。肿瘤组织微观变化:模型组呈现典型的恶性肿瘤细胞特征;中药各组出现凋亡特点,尤以高剂量组明显,出现凋亡小体;化疗组呈典型新月形凋亡;联合组核内染色质浓聚,边集,细胞器结构几乎全部消失,胞浆水肿,坏死严重。凋亡因子变化:与模型组比较,芪玉三龙汤高剂量组、化疗组可降低Bcl-2 m RNA水平(P<0.01);与化疗组相比,高剂量组和联合组Bcl-2m RNA表达水平有所降低,差异显著(P<0.01),但联合组与高剂量组比较没有差异(P>0.05)。与模型组比较,芪玉三龙汤高剂量组、化疗组能显著升高Bax m RNA表达(P<0.01);与化疗组比较,联合组Bax m RNA表达有升高趋势但无统计学意义(P>0.05)。3.2.2.2芪玉三龙汤对肿瘤组织mi RNA21 m RNA转录水平的影响与模型组相比,中药各剂量组的mi RNA21 m RNA相对表达水平较模型组有降低趋势,以高剂量组差异具有统计学意义(P<0.01),化疗组也可降低mi RNA21 m RNA表达(P<0.05);但与单用化疗药相比,二者联用无明显差异(P>0.05)。3.2.2.3芪玉三龙汤对肿瘤组织PTEN m RNA及蛋白表达的影响与模型组比较,以芪玉三龙汤高剂量组的PTEN蛋白及PTEN m RNA相对表达水平最高(P<0.01),化疗药亦可升高PTEN、PTEN m RNA的表达(P<0.01),联合组与化疗组相比对其表达的交互作用亦具有统计学意义(P<0.05)。3.2.2.4芪玉三龙汤对肿瘤组织PI3K/Akt/m TOR通路相关分子表达的影响PI3K p85α、PI3K p110α蛋白:芪玉三龙汤高剂量组、化疗组、联合组均可降低PI3K p85α、PI3K p110α蛋白表达,差异具有统计学意义(P<0.01);二药联用对PI3K p85α的交互效应亦具统计学意义(P<0.01)。Akt、p-Akt蛋白:芪玉三龙汤高剂量组、化疗组的Akt、p-Akt水平均较模型组降低(P<0.05),二者联用的交互效应亦具有统计学意义(P<0.01)。m TOR、p-m TOR蛋白:芪玉三龙汤高剂量组、化疗组的m TOR、p-m TOR蛋白水平较模型组降低(P<0.05),二药联用对m TOR表达水平的交互作用无统计学意义(P>0.05),但对p-m TOR表达具有统计学意义(P<0.01)。4结论基于“扶正消积”法创制的芪玉三龙汤具有改善荷肺癌小鼠的生存状态和免疫功能,抑制肺移植瘤的生长,促进肺癌细胞死亡,机制可能是介导PD-1/PD-L1以及PTEN/PI3K/Akt途径相关,通过下调PD-1、PD-L1表达,以及下调mi RNA21水平,上调PTEN表达,进而负向调控PI3K/Akt/m TOR信号通路发展。