论文部分内容阅读
疯草是豆科棘豆属和黄芪属含有苦马豆素的有毒植物的统称,其主要毒性成分为苦马豆素(swainsonine, SW),它是导致动物疯草中毒的根本原因。近年研究表明,疯草内普遍存在能产生SW的内生真菌——弯曲牙管蠕孢菌(Undifilum spp),该类内生真菌是疯草中SW产生的主要因素,抑制或阻断内生真菌合成SW,将有望降低或消除疯草的毒性。目前,疯草内生真菌中的SW合成途径仍不清楚,研究各种因素对SW合成的影响可为进一步阐释疯草内生真菌中SW的生物合成途径和分子调控机制奠定基础。本文主要对疯草中产SW内生真菌进行分离与鉴定,并研究不同因素对疯草内生真菌合成SW的影响,产SW内生真菌原生质体制备及再生,为进一步阐释疯草内生真菌中SW的生物合成途径、分子调控机制及疯草内生真菌突变菌株的选育奠定基础。1.从宁夏黄花棘豆中共分离到5株真菌,其中菌株NX-FEL001菌丝中含有苦马豆素,经诱导培养,该菌株能够产生分生孢子及分生孢子梗等结构,序列同源性和系统发育分析表明该菌株与Undifilum oxytropis真菌的亲缘关系最近,根据形态结构和分子进化分析结果将菌株NX-FEL001鉴定为U. oxytropis。2.研究不同pH、聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)、L-哌可酸、L-赖氨酸、α-酮戊二酸对U. oxytropis的生长和SW合成的影响。结果表明,当pH在4.5-6.5之间时,pH对U. oxytropis的生长无显著影响,但在该范围内,较低的pH可抑制真菌SW的合成；PEG可促进U. oxytropis的生长,但会抑制真菌SW的合成；L-哌可酸可显著促进U. oxytropis的生长,当其在培养基中的初始浓度为10-3mol/L和10-2mol/L时,真菌中SW的合成受到抑制,当其浓度为10-4mol/L时,真菌中SW的合成显著增加；当培养基中L-赖氨酸的初始浓度为10-3mol/L时,U. oxytropis中SW的合成显著增加,而当,L-赖氨酸的初始浓度为10-2mol/L或10-4mol/L时,真菌的SW合成受到显著抑制。当培养基中α-酮戊二酸的初始浓度分别为10-1mol/L、10-2mol/L、10-3mol/L时,U.oxytropis生长及SW合成的受到抑制；以上研究结果表明,L-哌可酸、L-赖氨酸、α-酮戊二酸可能是U.oxytropis合成SW的前体物质。3.悬菌液涂布于固体培养基上22℃培养15d,以1mol/L山梨醇配制1%纤维素酶+1%蜗牛酶+0.1%溶壁酶组成的复合酶系,在菌丝与酶解液质量体积比为1：10,酶解温度为35℃,80r/min振荡酶解3h时的条件下,U. oxytropis原生质体的生成量最大。纯化后的原生质体在1mol/L山梨醇配制的YCM再生培养基上可再生,再生率达8.5%,经检测再生后菌丝仍然能够产生SW。