前言创伤后应激障碍(posttraumatic stress disorder, PTSD)是由于异常威胁性或灾难性心理创伤导致出现长期持续性精神障碍,其临床表现以再度体验创伤为特征,并伴有情绪的易激惹和回避行为。简而言之,PTSD是一种创伤后心理失衡状态。近年来,随着战争、社会暴力事件、重大交通事故和自然灾害等创伤意外的不断增多,PTSD已经成为一种普遍的精神障碍而被关注。目前,PTSD及其神经生物学致病机制的探讨已成为涉及创伤学、神经精神病学、心理学等跨学科研究的重点。下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal, HPA)轴系统在应激反应调控中有重要作用。研究发现,PTSD不同于一般的应激反应及其它精神疾病,PTSD患者血液中的皮质酮基础水平往往较低,存在HPA轴的紊乱。糖皮质激素(GC)是肾上腺皮质分泌的重要应激激素。GC受体有糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)和盐皮质激素受体(mineralocorticoid receptor, MR)。海马是学习记忆的重要脑区,也是脑部GR含量最高的区域,因此在应激过程中海马是糖皮质激素攻击的主要靶区。近年来,对遭受战争和暴力之后的PTSD患者进行磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging, MRI)检查,发现有海马萎缩的现象。PTSD患者海马的形态结构在应激反应中发生了明显的变化,主要表现为体积变小,但其发生机制目前尚不明确。细胞凋亡是由基因控制的细胞主动性死亡过程,是机体生长发育、细胞分化、生理及病理性死亡的重要机制。细胞凋亡的调控,主要有三条诱导途径：外源性途径,即死亡受体途径；内源性途径,即线粒体途径；此外还有内质网途径。不同的死亡信号通过不同的途径诱导细胞凋亡。长期以来,线粒体一直被公认为细胞内的能量加工厂,其主要作用是为细胞的各种生命活动提供所需的能量。但越来越多的研究表明,在细胞凋亡过程中,许多重要事件的发生都与线粒体密切相关,如线粒体膜电位的丧失、细胞色素C (Cytochrome C, CytC)的释放、Bcl-2家族促进和抑制凋亡蛋白的参与等等。线粒体是细胞内死亡信号的重要感受器与放大器。在细胞凋亡早期,核染色体DNA还未改变之前,已出现线粒体结构和功能的变化,说明线粒体在细胞凋亡调控过程中起重要作用。凋亡信号经线粒体放大,线粒体再释放CytC、Smac/DIABLO和丝氨酸蛋白Omi/HtrA2,激活Caspase级联反应,最终引起凋亡,这是Caspase依赖的信号传导通路。线粒体也可释放凋亡诱导因子(apoptosis induce factor, AIF)、核酸内切酶G直接引起凋亡,这是Caspase非依赖的信号传导途径。线粒体在细胞凋亡机制中的作用越来越受到人们的关注。于是,有人提出GC受体可以与线粒体作用而诱导细胞凋亡的假说：第一,非基因组的作用。应激活化的大量GR可以直接与线粒体膜结合而改变线粒体膜电位。第二,基因组的作用。GC可以与其他的一些分子如热休克蛋白等相互作用,从而易位入细胞核,与DNA结合并影响转录活动。Bax作为GR活化的下游调制器之一,可以被上调并易位入线粒体与凋亡调制器MAP-1结合。这两种方式均可以导致线粒体膜电位改变。线粒体膜电位下降,即可引起线粒体膜间隙的CytC释放至胞质。释放入胞质的CytC在ATP或dATP的辅助下可特异地与凋亡蛋白酶激活因子(Apoptotic protease activating factors, Apaf-1)结合成复合体,启动Caspase-9形成全酶,导致Caspase-9活化。后者继续激活其下游分子,包括Caspase-3等,从而诱导细胞凋亡。在我国,由于地震、洪水等自然灾害时有发生,灾后一些人会出现长期焦虑与激动情绪。同时随着社会的发展、生活的节奏加快,来自社会、家庭、工作的压力不断增大,这些均成为PTSD诱发因素。因而如何治疗这些因灾难、压力而引起的精神疾病是一个刻不容缓的课题。以往由于缺乏理想的动物模型,使PTSD的基础研究受到了很大限制。SPS模型作为PTSD动物模型的确认,为深入研究应激障碍的发病机理提供了行之有效的方法。目前,关于PTSD细胞凋亡的研究国内外尚未见报道。因此,本课题引用国际上最新的SPS做为PTSD动物模型来进行PTSD的基础研究,首次揭示PTSD海马细胞凋亡、凋亡相关基因及线粒体通路的调控机制,从而为这一疾病的预防、诊断和治疗寻找一条有效的途径。实验方法采用国际认定的无连续单一应激(Single-Prolonged Stress, SPS)方法刺激大鼠建立PTSD大鼠模型。应用原位末端标记法(TUNEL染色法)检测PTSD大鼠海马细胞凋亡的规律；应用透射电子显微镜术观察PTSD大鼠海马凋亡细胞形态学变化；应用体视学方法测定PTSD大鼠海马体积的变化；应用免疫组织化学技术、免疫荧光技术及免疫印迹技术检测PTSD大鼠海马神经元凋亡相关因子Bcl-2、Bax、CytC、Caspase-9和Caspase-3蛋白含量的变化；应用RT-PCR技术检测凋亡相关基因Bcl-2和Bax mRNA含量的变化；应用免疫双标、激光共聚焦扫描显微镜技术观察PTSD大鼠海马Bcl-2和Bax以及Caspase-9和Caspase-3的表达与共存；应用酶电镜细胞化学技术观察PTSD大鼠海马线粒体细胞色素C的表达与释放。实验结果一、PTSD大鼠海马细胞凋亡的检测1、透射电镜观察凋亡细胞SPS刺激后,部分神经元出现细胞凋亡的改变。早期可见核染色质凝聚,沿核膜排列,形成新月形或不同大小和形状的团块。进一步发展,可见细胞核固缩,核膜内陷。细胞核裂解,胞质内出现多数的小泡,细胞膜消失。2、TUNEL染色结果PTSD大鼠海马中TUNEL阳性细胞数量明显多于正常对照组,且凋亡细胞数量随着时间的延长而逐渐增多,于SPS刺激后7d达高峰,之后逐渐减少。二、PTSD大鼠海马体积测定与正常对照组相比,模型组海马体积发生了变化,表现为体积缩小。三、PTSD大鼠海马凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达变化1、免疫组织化学结果在正常对照组,大鼠海马只有极少量的阳性细胞,染色较淡。SPS刺激后,Bcl-2和Bax表达均呈不同程度的增加。其中Bcl-2蛋白于SPS刺激后4d达到高峰,Bax蛋白于SPS刺激后7d达到高峰。2、免疫荧光双标结果激光共聚焦显微镜扫描结果显示,Bcl-2和Bax在海马神经元胞膜和突起均有着色。在SPS刺激后4d,两者表达均较强。3、Western Blotting分析结果与正常对照组相比,模型组海马Bcl-2和Bax蛋白水平均明显上调。PTSD早期,Bcl-2蛋白表达明显增强,于SPS刺激后4d达到高峰,此时显色最深；SPS刺激后7d表达下降,以后逐渐恢复。Bax蛋白于SPS刺激后7d达到高峰,之后表达逐渐减弱。与正常对照组相比,模型组海马Bcl-2/Bax比值逐渐减小,于SPS刺激后7d降至最低。4、RT-PCR结果与正常对照组相比,模型组海马Bcl-2和Bax mRNA水平均明显上调。PTSD早期,Bcl-2 mRNA水平就明显增强,于SPS刺激后4d达到高峰；SPS刺激后7d下降。SPS刺激后,Bax mRNA水平也显著上调,于SPS刺激后7d达到高峰。四、PTSD大鼠海马凋亡相关因子CytC的表达变化1、免疫组织化学结果在正常对照组,可见极少量的阳性细胞。CytC于SPS刺激后4d达到高峰并维持较高水平,SPS刺激7d之后表达逐渐下降,28 d恢复到正常水平。2、Western Blotting分析结果与正常对照组相比,模型组海马胞质和线粒体中CytC的水平均发生了显著变化。模型组海马线粒体中CytC蛋白水平明显下降,于SPS刺激后7d降至最低,以后逐渐恢复。模型组海马胞质内CytC蛋白水平则呈现相反趋势,明显上调,于SPS刺激后4d达到较高水平；SPS刺激7 d之后,表达逐渐下降。五、线粒体CytC酶电镜组织化学观察结果在正常对照组,线粒体内外膜可见大量CytC阳性反应产物。SPS刺激后4 d,线粒体发生了明显改变,表现为肿胀、空泡变性、嵴断裂；严重者呈气球样变,外膜破裂,CytC释放。六、PTSD大鼠海马神经元Caspase-9和Caspase-3的表达变化1、caspase-9免疫荧光结果在正常对照组,大鼠海马只有极少量的阳性细胞。SPS刺激后,Caspase-9阳性表达逐渐增强。SPS刺激后7d, Caspase-9阳性表达达到高峰。2、Caspase-3免疫组织化学结果在正常对照组,Caspase-3阳性表达较弱。SPS刺激后,其表达增强,于SPS刺激后7 d达到高峰,14d逐渐下降,28d恢复到正常水平。3、Caspase-9和Caspase-3免疫荧光双标结果激光共聚焦显微镜扫描结果显示,Caspase-3和Caspase-9在在海马神经元胞膜和突起均有着色,两者共存的细胞呈黄色。SPS刺激后7d,可见Caspase-3和Caspase-9阳性表达均较强,而Caspase-3阳性表达要强于Caspase-9。4、Western Blotting分析结果在正常对照组,无Caspase-9和Caspase-3活性片段；在模型组,出现Caspase-9及Caspase-3活性片段。Caspase-9活性片段于SPS刺激后1d升高,刺激后4d下降,而刺激后7d又再度达到高峰,之后逐渐下调。Caspase-3活性片段于SPS刺激后7d达到高峰,之后逐渐下调。结论1、PTSD大鼠出现了海马萎缩现象,神经元凋亡可能是导致PTSD大鼠海马发生萎缩的原因之一。2、凋亡相关基因Bcl-2和Bax含量增加以及两者比值的失衡可能是导致PTSD大鼠海马神经元发生凋亡的重要机制。3、在PTSD大鼠海马神经元中,线粒体肿胀、外膜破裂,大量CytC释放入胞质。4、CytC从线粒体释放入胞质是引发PTSD大鼠海马神经元凋亡的关键步骤。5、Caspase-9和Caspase-3在PTSD大鼠海马神经元凋亡的调控中均发挥了重要作用,线粒体通路的激活参与了PTSD大鼠海马神经元凋亡的调控。